Name: single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לחברי Nogales במעבדה באוניברסיטת קליפורניה בברקלי לסייע להקים את הפרוטוקולים ראשוני חברי וואנג במעבדה באוניברסיטת ייל ב עזרתם להקים את הפרוטוקולים מלא. אנחנו גם מכירים צוותי במתקן cryo-EM ואת בעל ביצועים גבוהים מרכז החישובים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל על תמיכתם. HW היא משפחת סמית awardee.

1. עקרון השיטה הטיה אקראית חרוטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העיקרון של השיטה להטות אקראי חרוטי מחייב לקיחת זוג micrographs של אותו האזור של הדגימה בתוך מיקרוסקופ אלקטרונים. תמונה אחת נלקחת של הדגימה במצב untilted (איור 1A) והתמונה אחרים נלקחת של הדגימה נטו...

<ol>
	<li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution:+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction.">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series.">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li><li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+at+improved+resolution:+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles.">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy.">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+and+WEB:+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields.">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li><li>Heel, M. v. a. n., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li><li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN:+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions.">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li><li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3'+end+processing.">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li><li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp.">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li><li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation.">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li></ol>

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט של הכנת המדגם ושלושה שחזור ממדי של המתחם exosome באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שלילי מכתים. באמצעות שיטה זו, השגנו את השחזור באמצעות 3D להטות אקראי שיטה חרוטי ללא כל ידע מוקדם של המבנה. הטיה אקראית שיטה חרוטי לא בהכרח דורשת מדגם הומוגני אך...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Polyvinyl Formal Resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Science</td>
<td>63450-15-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uranyl Formate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Science</td>
<td>22451</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superfrost Microscope Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientist </td>
<td>4951F-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>400 mesh grid regular</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SPI Supplies</td>
<td>3040C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbon coater Auto 306</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Edwards</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tecnai-12 Electron Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FEI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glow Discharger</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BAL-TEC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sputter Coater SCD 005</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method

חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) שחזור לאחרונה הפך לכלי פופולרי כדי לקבל את תלת ממדי (3D) מבנה של קומפלקסים macromolecular גדול. לעומת קריסטלוגרפיה רנטגן, יש לו כמה יתרונות ייחודיים. ראשית, אחד החלקיקים EM שחזור לא צריך לגבש את המדגם חלבון, המהווה את צוואר הבקבוק קריסטלוגרפיה רנטגן, במיוחד עבור מתחמי macromolecular גדול. שנית, זה לא צריך כמויות גדולות של דגימות חלבון. לעומת מיליגרם של החלבונים הדרושים התגבשות, יחיד שחזור EM החלקיקים רק צריך כמה מיקרו ליטר פתרון חלבון ננו טוחנת ריכוזים, באמצעות צביעה בשיטה שלילי EM. עם זאת, למרות כמה אסיפות macromolecular עם סימטריה גבוהה, חלקיק יחיד EM מוגבל ברזולוציה נמוכה יחסית (ברזולוציה נמוכה יותר מאשר 1 ננומטר) עבור דגימות רבים במיוחד אלה ללא סימטריה. טכניקה זו היא מוגבלת גם על ידי גודל של מולקולות הנחקרת, כלומר 100 kDa עבור דגימות מוכתם שלילי 300 kDa עבור קפוא hydrated דגימות בכלל. עבור מדגם חדש של מבנה ידוע, אנחנו בדרך כלל להשתמש בפתרון מתכות כבדות להטביע את המולקולות על ידי מכתים שלילי. הדגימה נבדקת אז מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים לקחת דו ממדי (2D) micrographs של המולקולות. באופן אידיאלי, מולקולות חלבון יש מבנה 3D הומוגנית אבל התערוכה אוריינטציות שונות micrographs. Micrographs אלה דיגיטציה ומעובד מחשבים כמו &quot;חלקיקי בודד&quot;. שימוש דו מימדי יישור וטכניקות סיווג, מולקולות הומוגנית בתצוגות אותו מקובצים לתוך הכיתות. הממוצעים שלהם לשפר את האות של צורות 2D של המולקולה. אחרי שאנחנו להקצות את חלקיקי עם אוריינטציה היחסי הנכון (זוויות אוילר), נוכל לשחזר את תמונות החלקיקים 2D לתוך נפח 3D הווירטואלי. בשחזור חלקיק בודד 3D, צעד חיוני היא נכונה להקצות את הכיוון הנכון של כל חלקיק יחיד. ישנן מספר שיטות כדי להקצות את התצוגה עבור כל חלקיק, כולל בריאורגניזציה זוויתי 1 ו אקראי להטות חרוטי (RCT) שיטה 2. בפרוטוקול זה, אנו מתארים תרגול שלנו מקבל את שחזור 3D מורכבים תוך שימוש בשמרים exosome מכתים EM שלילי RCT. יצוין כי הפרוטוקול שלנו במיקרוסקופ אלקטרונים ועיבוד תמונה כדלקמן את העיקרון הבסיסי של RCT אבל היא לא הדרך היחידה לבצע את השיטה. אנחנו הראשונים מתארים כיצד להטביע את דגימת החלבון לתוך שכבת Formate-Uranyl עם עובי דומה לגודל חלבון, באמצעות רשת פחמן המחוררת מכוסה בשכבה של הסרט רצוף פחמן דקה. לאחר מכן הדגימה מוכנס לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים לאסוף untilted (0 מעלות) ו מוטה (55 מעלות) זוגות micrographs שישמש מאוחר יותר לצורך עיבוד וקבלת מודל 3D הראשונית של exosome את השמרים. לשם כך, אנו מבצעים RCT ולאחר מכן לחדד את מודל 3D הראשוני באמצעות הקרנת התאמת שיטת חידוד 3.

Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method at JoVE.com

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

מאמר זה מתאר שיטה סטנדרטית לקבל תלת ממדי (3D) שחזור של מקרומולקולות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מכתים שלילי (EM). בפרוטוקול זה, אנו מסבירים כיצד לקבל את מבנה 3D של מורכבות exosome cerevisiae Saccharomyces ברזולוציה בינונית באמצעות שחזור אקראי חרוטי להטות את השיטה (RCT).

חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים שיקום במתחם Exosome שימוש בשיטה אקראיים הטיה חרוטי

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

טכני אלמנטים בסיסיים של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט בביולוגי מיקרוסקופית אלקטרונים

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

חוקרים את מזיקה אפקטים של נמוך לחץ פלזמה עיקור על ההישרדות של Bacillus subtilis הנבגים באמצעות Live התא מיקרוסקופ

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

בידוד והדמיה פלורסצנטיות עבור שחזור יחיד-חלקיקים של Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

שחזור חתימות פלואורסצנטיות מולדות חד-תאיות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

הכנת רשת מיקרוסקופית קריו-אלקטרון למחקרים שנפתרו בזמן באמצעות מערכת רובוטית חדשנית, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...