Name: single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method at JoVE.com

Författarna vill tacka medlemmarna i Nogales lab på UC-Berkeley i hjälper till att etablera den första protokollen och medlemmar av Wang lab vid Yale University i deras hjälp för att upprätta fullständiga protokoll. Vi erkänner också den personal i Cryo-EM anläggning och högpresterande Beräkning Center vid Yale School of Medicine för deras stöd. HW är en Smith Family bidraget.

1. Principen om Random Konisk Tilt metod <ol><li> Principen om slumpmässig koniska luta metoden kräver att ett par av micrographs i samma region av prov inuti elektronmikroskop. En bild är tagen av provet i en icke vridna position (Figur 1A) och den andra bilden är tagen av provet lutar mellan 50 till 70 grader (i vårt fall använder vi 55 grader). (Figur 1B) </li><li> Med hjälp av datorn, är den digitaliserade mikroskop paret satte sida vid sida och bilder från samma partiklar är markerade. (Figur 1C) </li><...

<ol>
	<li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution:+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction.">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series.">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li><li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+at+improved+resolution:+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles.">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy.">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+and+WEB:+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields.">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li><li>Heel, M. v. a. n., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li><li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN:+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions.">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li><li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3'+end+processing.">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li><li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp.">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li><li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation.">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li></ol>

I denna artikel presenterar vi ett detaljerat protokoll av provpreparering och tredimensionell rekonstruktion av exosome komplexa med negativ mikroskopi färgning elektron. Med denna metod fick vi 3D-rekonstruktion med slumpmässiga koniska luta metod utan några förkunskaper i strukturen. Slumpmässiga koniska luta metod kräver inte nödvändigtvis ett homogent prov men följande projektion matchande förfining steg skulle behöva en homogen prov för att uppnå hög upplösning. För neg...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Polyvinyl Formal Resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Science</td>
<td>63450-15-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uranyl Formate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Science</td>
<td>22451</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superfrost Microscope Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientist </td>
<td>4951F-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>400 mesh grid regular</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SPI Supplies</td>
<td>3040C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbon coater Auto 306</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Edwards</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tecnai-12 Electron Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FEI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glow Discharger</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BAL-TEC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sputter Coater SCD 005</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method

Enda partikel elektronmikroskopi (EM) rekonstruktion har nyligen blivit ett populärt verktyg för att få den tredimensionella (3D) strukturen av stora makromolekylära komplex. Jämfört med röntgenkristallografi, har några unika fördelar. Först behöver enskild partikel EM rekonstruktion inte att kristallisera proteinet provet, som är flaskhalsen i röntgenkristallografi, särskilt för stora makromolekylära komplex. För det andra behöver det inte stora mängder protein prover. Jämfört med milligram av proteiner som behövs för kristallisering, behöver enskild partikel EM återuppbyggnaden bara några mikro-liter protein lösning på nanonivå molära koncentrationer, med hjälp av negativ färgning EM metod. Men trots ett par makromolekylära församlingar med hög symmetri, EM enda partikel är begränsat till relativt låg upplösning (mindre än 1 nm upplösning) i många exemplar, särskilt de utan symmetri. Denna teknik också begränsas av storleken på de molekyler som studeras, dvs 100 kDa för negativt färgade exemplar och 300 kDa för frysta hydrerad exemplar i allmänhet. För ett nytt prov med okänd struktur, använder vi i allmänhet en tungmetall lösning för att bädda in molekyler av negativa färgning. Provet undersöks sedan i ett transmissionselektronmikroskop att ta två-dimensionella (2D) micrographs av molekylerna. Helst av proteinmolekyler har en homogen 3D-struktur men uppvisar olika inriktningar i micrographs. Dessa micrographs är digitaliserade och bearbetas i datorer som &quot;enstaka partiklar&quot;. Med hjälp av två-dimensionell uppriktning och tekniker klassificering, är homogena molekyler i samma åsikter klustrade i klasser. Deras genomsnitt öka signalen av molekylen är 2D-former. Efter att vi tilldela partiklarna med rätt relativ orientering (Euler vinklar), kommer vi att kunna rekonstruera 2D-partikel bilder i en 3D virtuell volym. I enstaka partikel 3D-rekonstruktion, är ett viktigt steg att korrekt tilldela rätt orientering för varje enskild partikel. Det finns flera metoder för att tilldela vyn för varje partikel, inklusive den kantiga beredning 1 och slumpmässiga koniska lutning (RCT) metod 2. I detta protokoll, beskriver vi vår verksamhet med att få 3D-rekonstruktion av jäst exosome komplexa med negativ färgning EM och RCT. Det bör noteras att vår protokollet för elektronmikroskopi och bildbehandling följer den grundläggande principen för RCT, men är inte det enda sättet att utföra metoden. Vi beskriver först hur att bädda in proteinet provet i ett lager av AUC-Formate med en tjocklek jämförbar med protein storlek, med hjälp av en Holey kol galler täckt med ett lager av tunt kol film. Sedan provet sätts in i ett transmissionselektronmikroskop att samla in icke vridna (0-grader) och lutande (55 grader) par micrographs som kommer att användas senare för bearbetning och få en första 3D-modell av jäst exosome. I detta syfte utför vi RCT och sedan förfina de ursprungliga 3D-modellen med hjälp av projektion matchande förfining metod 3.

Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method at JoVE.com

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Denna artikel beskriver en standardiserad metod för att få en tredimensionell (3D) rekonstruktion av biologiska makromolekyler med hjälp av negativ mikroskopi färgning elektron (EM). I detta protokoll förklarar vi hur du får 3D-strukturen för Saccharomyces cerevisiae exosome komplex på medelhög upplösning med hjälp av slumpmässiga koniska metoden lutning rekonstruktion (RCT).

Enda partikel elektronmikroskopi Rekonstruktion av Exosome Complex Använda Random Konisk Tilt metod

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Metod för mätning av Viral Fusion Kinetics på enskild partikel nivå

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analys av Random migration av celler med Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Fundamental Teknisk Delar av Freeze-fraktur / Freeze-Etch i biologisk elektronmikroskopi

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Utreda skadliga effekter av låg trycket Plasma sterilisering på överlevnaden för Bacillus subtilis sporer med Live Cell mikroskopi

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolering och fluorescens Imaging för singel-partikel rekonstruktion av Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiska provberedning genom högtrycks frysning, mikrovågsugn-assisted kontrastförbättring, och Minimal harts inbäddning för volym Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

CryoAPEX-metoden för elektronmikroskopi analys av membranproteinlokalisering inom ultrastrukturellt bevarade celler

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Rekonstruktion av encelliga medfödda fluorescenssignaturer av konfokal mikroskopi

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Cryo-Elektron mikroskopiska rutnät förberedelse för tidsuppgjorda studier med hjälp av ett nytt robotsystem, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...