Name: single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method at JoVE.com

Yazarlar tam protokolleri kurmak için onların yardımına Yale Üniversitesi&#39;nde ilk protokolleri ve Wang laboratuar kurmak yardımcı UC-Berkeley Nogales laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, verdikleri destek için Yale Tıp Okulu&#39;nda cryo-EM tesis ve Yüksek Başarımlı Hesaplama Merkezi değnek kabul etmiş oluyorsunuz. HW Smith Aile Awardee.

1. Rastgele Konik Tilt Yönteminin Prensibi <ol><li> Rasgele konik tilt yönteminin ilkesi, elektron mikroskobu içinde numunenin aynı bölgede mikrograflar, bir çift alarak gerektirir. Bir resim bir untilted konumda (Şekil 1A) numune alınır ve başka bir resim, 50 ila 70 derece (bizim durumumuzda, biz 55 derece) arasında bir açıyla eğik numune alınır. (Şekil 1B) </li><li> Seçilen bilgisayar kullanarak, sayısallaştırılmış mikrografı çifti aynı parçacıklar ve görüntüleri yan yana konur. (Şek...

<ol>
	<li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution:+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction.">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series.">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li><li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+at+improved+resolution:+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles.">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy.">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+and+WEB:+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields.">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li><li>Heel, M. v. a. n., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li><li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN:+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions.">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li><li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3'+end+processing.">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li><li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp.">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li><li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation.">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li></ol>

Bu yazıda, numune hazırlama, ayrıntılı protokol ve negatif boyama elektron mikroskobu kullanarak exosome kompleks üç boyutlu rekonstrüksiyon sunuyoruz. Bu yöntemi kullanarak, yapının herhangi bir ön bilgi olmadan rastgele konik eğim yöntemi kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon aldı. Rastgele konik eğim yöntemi mutlaka homojen bir örnek gerektirmez, ancak aşağıdaki projeksiyon eşleşen arıtma adım yüksek çözünürlük elde etmek için homojen bir numune gerekir. Ol...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Polyvinyl Formal Resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Science</td>
<td>63450-15-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uranyl Formate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Science</td>
<td>22451</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superfrost Microscope Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientist </td>
<td>4951F-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>400 mesh grid regular</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SPI Supplies</td>
<td>3040C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbon coater Auto 306</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Edwards</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tecnai-12 Electron Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FEI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glow Discharger</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BAL-TEC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sputter Coater SCD 005</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method

Tek parçacık elektron mikroskobu (EM) yeniden yapılanma büyük makromoleküler kompleksleri, üç boyutlu (3D) bir yapı elde etmek için son zamanlarda popüler bir araç haline gelmiştir. X-ışını kristalografisi ile karşılaştırıldığında, bazı benzersiz avantajlar vardır. İlk olarak, tek bir parçacık EM yeniden yapılanma, özellikle büyük makromoleküler kompleksleri için X-ışını kristalografisi darboğaz protein örnek, kristalize değildir. İkincisi, büyük miktarda protein örneklerinin gerek yoktur. Kristalizasyon için gerekli proteinlerin miligram ile karşılaştırıldığında, tek parçacık EM yeniden yapılanma sadece negatif boyama EM yöntemi kullanarak nano-molar konsantrasyonlarda protein çözüm çeşitli mikro-litre ihtiyacı var. Ancak, yüksek simetri birkaç makromoleküler meclisleri olmasına rağmen, tek bir parçacık EM özellikle de simetri olmadan birçok örnekler için (1 nm den daha düşük çözünürlük) nispeten düşük çözünürlükte sınırlıdır. Bu teknik, aynı zamanda çalışmanın altında moleküllerin büyüklüğü ile sınırlıdır, yani genel olarak dondurulmuş sulu numuneler için olumsuz lekeli örnekleri ve 300 kDa 100 kDa. Yapısı bilinmeyen yeni bir örnek için, genelde negatif boyama ile moleküller gömmek için bir heavy metal çözümü kullanın. Daha sonra örnek moleküllerin iki boyutlu (2D) mikrograflar almak için bir transmisyon elektron mikroskopta incelenir. İdeal olarak, protein molekülleri, homojen bir 3D yapıya sahip ancak farklı yönelimleri mikrograflar gösterirler. Bu mikrograflar &quot;tek parçacıklar&quot; olarak sayısallaştırılmış ve bilgisayarlara işlenir. Iki boyutlu bir uyum ve sınıflandırma teknikleri kullanarak, aynı görüşleri homojen moleküllerin sınıfa kümelenmiş. Onların ortalamalar molekülün 2D şekilleri sinyal artırır. Biz doğru bağıl yönelimi (Euler açıları) parçacıklar atadıktan sonra, biz, 2 boyutlu, 3 boyutlu bir sanal hacmin içine parçacık görüntüleri yeniden inşa etmek mümkün olacak. Tek parçacık 3D rekonstrüksiyon, önemli bir adım, tek tek her parçacığın uygun yönlendirmeyi doğru atamak. Açısal sulandırıldıktan 1 ve rastgele konik tenteli (RCT) yöntem 2 de dahil olmak üzere, her parçacık görünümü atamak için çeşitli yöntemler vardır. Bu protokol, maya exosome kompleksi negatif boyama EM ve RCT kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon almak bizim uygulama açıklar. Elektron mikroskobu ve görüntü işleme protokol RCT temel prensibi izler ama yöntemi gerçekleştirmek için tek yol olduğunu belirtmek gerekir. Önce, sürekli ince bir karbon film tabakası ile kaplı bir holey karbon ızgarası kullanılarak, uranil-biçimleri protein boyutu ile karşılaştırılabilir bir kalınlığında bir tabaka haline protein örnek gömmek nasıl açıklar. Sonra örnek toplamak için bir transmisyon elektron mikroskobu eklenir untilted (0 derece) ve işleme ve maya exosome bir ilk 3D model elde etmek için daha sonra kullanılabilir olacak mikrograflar eğimli (55 derece) çifti. Bu amaçla, biz RCT gerçekleştirmek ve daha sonra arıtma yöntemini 3 uyan projeksiyon kullanarak ilk 3D model rafine .

Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method at JoVE.com

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Bu makale, negatif boyama elektron mikroskobu (EM) kullanarak biyolojik makromoleküllerin üç boyutlu (3B) rekonstrüksiyonu almak için standart bir yöntem açıklanır. Bu protokolde, rasgele konik eğim rekonstrüksiyon yöntemi (RCT) ile orta çözünürlükte Saccharomyces cerevisiae exosome kompleks 3D yapısı nasıl açıklayabilir.

Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Biyolojik Elektron Mikroskopi Freeze-kırık / Freeze etche Temel Teknik Elemanları

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Zararlı etkileri, düşük basınç plazma sterilizasyon Bacillus subtilis sporlar kullanarak canlı cep mikroskobu sağkalıma soruşturma

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Yalıtım ve floresan görüntüleme Chlamydomonas Centrioles tek-parçacık yeniden inşası için

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Tek Hücreli Doğuştan Gelen Floresan İmzalarının Konfokal Mikroskopi ile Yeniden Yapılandırılması

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...