Name: myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle
Uploaded: 2011-02-22T18:15:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een GGD Grant (HL086513) van NHLBI tot PEO, en een uitgebreide Research Grant van het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (RC1-00104), een Public Health Service Grant (HL085377) van NHLBI, en een gift van de Pollin Stichting HSB SC werd ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde Bridges to Cell Research Award (TB1-01194) naar San Francisco State University Stem.

Het protocol is uitgevoerd met de goedkeuring van de UCSF Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). 1. Dissectie van de muis extensor digitorum longus (EDL) Muscle <ol><li> Voer alle dierlijke procedures in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. </li><li> Euthanaseren van dieren met 200 mg / kg intraperitoneaal pentobarbital / cervicale dislocatie net voor de spieren oogst 10. De dissectie moet zo goed worden beoefend, dat de spier kunnen worden geoogst en gemonteerd in de spanning transducer binnen 15 minuten van euthanasie. </li><li> Schik karkas rugligging op dissectie tray en pin been naar de tray. </li><li> Onder dissectie microscoop, open huid, voorzichtig open fascia (Fig.1A), en de schil tibialis van de enkel naar boven bloot te leggen EDL (Fig.1B). Gebruik druppels Ringerlactaat te houden van de spieren vochtig en gebufferd tijdens de oogst. </li><li> Verwijder de EDL, met behoud van zo veel pees mogelijk op elk uiteinde, en in een petrischaal met Ringer-Lactaat oplossing. Tie hechting aan elk van de pezen van de spieren (Fig.1C). Het is essentieel dat de spiervezels niet worden aangeraakt of gestoord tijdens de dissectie. </li></ol> 2. Montage van de Muis EDL in de Muscle Strip Myograph <ol><li> Voor deze studies, is een weefsel bad nodig die stelt de spier tijdens het op in fysiologische oplossing baden bij constante temperatuur met continue zuurstof. Het bad is gekoppeld aan een krachtopnemer voor het meten van spierspanning. Wij maken gebruik van een geïntegreerd spier strip myograph bad van Deense Myo Technologie (DMT Model 820MS) voor dit doel. Daarnaast worden een vierkant puls elektrische stimulator (Grass Model S48) en data-acquisitie platform (ADInstruments PowerLab Data Acquisition System en LabChart software) die nodig is om te lokken, en opnemen analyseert myo-mechanische reacties, respectievelijk. De DMT 820MS heeft platina-elektroden geïntegreerd in het deksel van die zijn geplaatst aan weerszijden van de spier, in het midden-gedeelte van de spier strip. Andere myographs kunnen vereisen specifieke aandacht voor de plaatsing van de elektroden. </li><li> Vul myograph bad met 5 ml Krebs Henseleit-oplossing 11. Warm tot 25 ° C. Bubble O 2 / CO 2 (95% / 5%) via bad gedurende 15 minuten voorafgaand aan gebruik. </li><li> Gebruik hechtingen aan EDL uit te breiden tussen de klemmen van myograph en de pezen van de EDL spier (Fig.1D, E) veilig tussen de klemmen. Wees voorzichtig dat u de spier zelf klem. </li><li> Handhaaf myograph bad bij 25 ° C. </li></ol> 3. Myo-mechanische analyse A. Twitch spanning <ol><li> Stel de eerste lengte in het bad, zodat er geen spier laksheid. </li><li> Bepaal maximale stimulus (duur 0,5 ms) door het aanpassen van spanning om maximale twitch spanning te verkrijgen, vervolgens stimulus op 20% boven de maximale (tot supramaximale stimulus te bereiken). In onze studies, is het supramaximale stimulus meestal bereikt bij een uitgang van 40 volt. </li><li> Controleer of uitgang van de stimulator met behulp van een oscilloscoop. </li><li> Bepaal optimale lengte door geleidelijk het uitrekken van de spier totdat er geen verdere toename van de twitch spanning. </li><li> Laat spieren in evenwicht gedurende 3 minuten. </li><li> Lever supramaximale vierkante stimulus (0,5 ms) bij optimale lengte met behulp van Grass S44 elektronische stimulator, en opnemen output. </li><li> Record: twitch spanning curve (P t vs tijd; fig. 2a). </li></ol> B. Tetanus spanning <ol><li> Laat spieren rusten gedurende 3 minuten. </li><li> Breng een trein van supramaximale stimuli voor 300msec op 150 Hz op optimale lengte met behulp van Grass S44 elektronische stimulator, en opnemen output. </li><li> Record: tetanus spanning curve (P o vs tijd; Fig.2B). </li></ol> C. Force-frequentie <ol><li> Laat spieren rusten gedurende 3 minuten. </li><li> Force-frequentie: van toepassing treinen van supramaximale stimuli op 30, 60, 100, 140, en 160 Hz met 3 minuten rust tussen elke stimulus (Fig.3). Als alternatief kunnen treinen worden toegepast 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 en 160 Hz voor een betere resolutie bij lagere frequenties, waar de kracht verandert aanzienlijk. </li><li> Plot: kracht-frequentie relatie (% maximale kracht vs stimulatie frequentie). </li></ol> D. Vermoeidheid <ol><li> Van toepassing zijn trein van korte tetani: 60 Hz voor 300 ms (of frequentie ingesteld op 50% van de piek kracht produceren), elke 3 seconden gedurende 10 minuten. Met 10 minuten, moet de tetanische kracht dalen tot een plateau niveau van ~ 15% van de oorspronkelijke waarde (Fig.4). </li><li> Plot: lage frequentie vermoeidheid (% maximale kracht vs tijd). </li></ol> E. Aanvullende gegevens verzamelen aan het eind van het protocol <ol><li> Voordat ontkoppelen de spier van de myograph, stelt u de Muscle op optimale lengte, zoals bepaald in stap III.A.4 en meet de diameter met behulp van een oculair op de microscoop of met remklauwen. Bereken doorsnede (um 2). </li><li> Meet spiermassa (mg) door het verwijderen van hechtingen en een gewicht van spieren. </li><li> Weeg de muis om het lichaamsgewicht (g) te beoordelen. </li></ol> 4. Berekeningen <ol><li> Spier: body mass ratio = spiermassa / body mass </li><li> Twitch spanning, P t (mN) = maximale spanning die tijdens twitch </li><li> Specifieke twitch spanning (N / cm 2) = twitch spanning (mN) / doorsnede (um 2) x 10 5 N / mN • um 2 / cm 2 </li><li> Tijd om piek spanning (ms) = de tijd vanaf het begin van de contractie om een ​​maximale spanning </li><li> Half-relaxatietijd (ms) = tijd van piek spanningen tot 50% van de piek spanning </li><li> Tetanische spanning, P O (MN) = maximale spanning die tijdens tetanus </li><li> Specifieke tetanische spanning (N / cm 2) = tetanische spanning (mN) / doorsnede (um 2) x 10 5 N / mN • um 2 / cm 2 </li><li> Maximale snelheid van de stijging van tetanus (N / s) = maximumpercentage van de stijging van de spanning tijdens de spanning stijging van tetanus, dat wil zeggen, de maximale helling van de tetanische spanning curve (of, dP O / dt) </li><li> Half-relaxatie tetanische spanning (ms) = tijd van beëindiging van stimulatie tot 50% van de spanning bij beëindiging van de stimulatie </li><li> Twitch spanning-to-tetanische spanning ratio, P t / O = P maximale twitch spanning / maximale tetanische spanning </li><li> Vermoeidheid index = verhouding van de spanning na twee minuten met een lage frequentie vermoeidheid tot maximale isometrische spanning </li></ol> 5. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Dissectie van EDL spier. A, Blootstelling van achterbeen muscles.TA, tibialis anterior. B, Blootstelling van EDL (extensor digitorum longus) spier. C, Bevestigen van hechtingen aan EDL pezen. D, Tension transducer bad (view van de zijkant). E, EDL gemonteerd in bad (bovenaanzicht). De spier in onvolledig ondergedompeld in de buffer voor illustratieve doeleinden, in de praktijk, de spier moet volledig worden ondergedompeld om te voorkomen dat uitdroogt. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Voorbeeld van spanning bochten. A, voorbeeld van de twitch spanning curve illustreert maximale twitch spanning (P t), contractie tijd (CT) en de half-relaxatietijd (HRT). Bar, 1s. B, Voorbeeld van tetanische spanning lijn die de maximale tetanische spanning (P o) en half-relaxatie tetanische spanning (HRTT). Bar, 1s. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Voorbeeld van een kracht-frequentie-relatie-analyse. A, spanningen opgewekt door incrementele stimulatie frequenties. B, Voorbeeld van een puls trein op 30MHz. Bar, 80ms. C, Voorbeeld van een puls trein op 140MHz. Bar, 80ms. D, Voorbeeld van een kracht-frequentie curve afgeleid uit gegevens in A. De vorm van de kracht-frequentie curve is kenmerkend voor spierkracht, en kan worden vergeleken tussen de spieren van verschillende dieren. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Voorbeeld van een lage frequentie vermoeidheid-analyse. A, afnemende spanningen opgewekt over periode van lage frequentie stimulation.Examples van pulsreeksen bij bepaalde tijdstippen (B, C, D) worden hieronder weergegeven. E, Voorbeeld van een lage frequentie vermoeidheid curve afgeleid uit gegevens in A. De vorm van de lage frequentie vermoeidheid curve is kenmerkend voor spierkracht, en kan worden vergeleken tussen de spieren van verschillende dieren.

<ol>
	<li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue.">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).</li><li>Messina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+overexpression+via+adeno-associated+virus+gene+transfer+promotes+skeletal+muscle+regeneration+and+enhances+muscle+function+in+mdx+mice.">VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice.</a> FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).</li><li>Danieli-Betto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+protects+mouse+extensor+digitorum+longus+skeletal+muscle+during+fatigue.">Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).</li><li>MacIntosh, B. R., Willis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-frequency+relationship+and+potentiation+in+mammalian+skeletal+muscle.">Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).</li><li>Hayes, A., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+clenbuterol-treated+mdx+muscle+are+enhanced+by+low-intensity+swimming.">Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming.</a> J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).</li><li>Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy:+II.+Contractile+properties.">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).</li><li>Danieli-Betto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+alpha-sarcoglycan+differently+affects+fast-+and+slow-twitch+skeletal+muscles.">Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).</li><li>Chan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+for+speed:+contractile+properties+of+isolated+whole+EDL+muscle+from+an+alpha-actinin-3+knockout+mouse.">A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).</li><li>Personius, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grip+force,+EDL+contractile+properties,+and+voluntary+wheel+running+after+postdevelopmental+myostatin+depletion+in+mice.">Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice.</a> J Appl. , (2010).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).</li><li>Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibre+bundles+from+mice+deficient+in+carbonic+anhydrase+II.">Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II.</a> Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).</li></ol>

Beschrijven we een gedetailleerde benadering van de evaluatie myo-mechanische eigenschappen in geëxplanteerd achterbeen spieren van de muis. De EDL, terwijl moeilijker te ontleden vanwege de achterste positie achter de tibialis anterior spier, is gemakkelijker te beoordelen dan de tibialis anterior vanwege zijn prominente tendineuze bijlagen aan de enkel-en kniegewrichten. Deze pezen voor montage in de spier strip myograph. In tegenstelling tot de meer gemakkelijk bereikbaar tibialis anterior heeft een brede, bijna atendinous gehechtheid aan het kniegewricht, waardoor het buitengewoon moeilijk om zowel ontleden, zonder afbreuk te doen aan de spier, en veilig monteren in de myograph. We wijzen er ook op dat snel monteren van de spier in een zuurstofrijke bad in fysiologische buffer en de temperatuur is essentieel voor het behoud van de spieren van de mechanische eigenschappen. We hebben ontdekt dat we deze analyse herhalen voor maximaal 30 minuten zonder significante veranderingen in de spieren reactie onder deze omstandigheden. Tot slot is het essentieel dat de spiervezels niet worden aangeraakt tijdens de dissectie en montage procedures, omdat dit nadelige gevolgen kunnen hebben op de spierfunctie, en leiden tot onderschatting van myo-mechanische kracht. Door het volgen van deze procedures, deze analyse biedt een robuuste kwantitatieve benadering van de evaluatie van de effecten van genetische modificatie op de spierfunctie 6,7,8,9, evenals vergelijking tussen de therapeutische interventies in muismodellen van spierziekte 1,2,3,5 .

Oplossingen en Media Ringer-Lactaat oplossing <ul><li> 100 mM NaCl </li><li> 30 mM CH3CH (OH) COONa (natrium lactaat) </li><li> 4 mM KCl </li><li> 1 mM CaCl 2 2H 2 O (calcium chloride dihydraat) <ul><li> de pH instellen op 6,75 </li></ul></li></ul> Krebs Henseleit oplossing <ul><li> 118 mM NaCl </li><li> 4,7 mM KCl </li><li> 1,25 mM CaCl 2 </li><li> 1.2 mM MgCl 2 </li><li> 1,2 mM KH 2 PO 4 </li><li> 25 mM NaHCO 3 </li><li> 11 mM glucose <ul><li> breng de pH op 7,2-7,4 door equilibreren met O 2 / CO 2 (95% / 5%) gas </li></ul></li></ul> Pentobarbital <ul><li> 5 mg / ml werkoplossing in steriel water </li></ul>

myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle

Om de in vivo effecten van therapeutische interventies voor de behandeling van spierziekte 1,2,3, zijn kwantitatieve methoden nodig die maatregel de troepenmacht en de vermoeidheid in de behandelde spier. Beschrijven we een gedetailleerde benadering van de evaluatie myo-mechanische eigenschappen in vers geëxplanteerd achterbeen spieren van de muis. We beschrijven de atraumatische oogst van de muis extensor digitorum longus, de montage van de spier in een spier strip myograph (Model 820MS; Deense Myo Technology), en de meting van de maximale twitch en tetanische spanning, samentrekking tijd, en half-relaxatie tijd, met behulp van een square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Met behulp van deze metingen, tonen we de berekening van de specifieke twitch en tetanische spanning genormaliseerd naar spier dwarsdoorsnede, de twitch-to-tetanische spanning ratio, de kracht-frequentie relatie curve en de lage frequentie curve vermoeidheid 4. Deze analyse biedt een methode voor kwantitatieve vergelijking tussen de therapeutische interventies in muismodellen van spierziekte 1,2,3,5, evenals de vergelijking van de effecten van genetische modificatie op de spierfunctie 6,7,8,9.

Watch this Scientific Journal Video about Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle at JoVE.com

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

Voor de beoordeling van de<em&gt; In vivo</em&gt; Effecten van therapeutische interventies voor spier-en vaatziekten, zijn methoden nodig om de troepenmacht en de vermoeidheid in de behandelde spier kwantificeren. We detail een methode om te beoordelen myo-mechanische eigenschappen in geëxplanteerd muis achterbeen spieren. Deze analyse geeft een robuuste aanpak ontwikkelen om kwantificeren van de effecten van genetische modificatie op de spierfunctie, evenals de vergelijking van therapieën in muismodellen van spierziekte.

Myo-mechanische analyse van geïsoleerde Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Skeletspieren Geslacht dimorfisme van Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

Scheenbeen Nerve doorsnijding - Een gestandaardiseerd model voor denervatie-geïnduceerde Skeletal Muscle Atrofie in Muizen

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified BergstrÃƒÆ’Ã‚Â¶m Technique

Human Skeletal Muscle biopsie procedures met behulp van de Modified Bergström Techniek

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative Magnetic Resonance Imaging van de skeletspieren Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Do&#39;s en Don&#39;ts in de voorbereiding van Muscle Weefsel secties voor histologische analyse

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

menselijk<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; Skeletal spierbiopsie Met behulp van de Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Inductie en beoordeling van exertionele Skeletal spierbeschadiging in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Semi-geautomatiseerde analyse van muis skeletspieren morfologie en vezel-achtige samenstelling

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with 'One Stop Shop' Near-infrared Spectroscopy

Skeletal Muscle neurovasculaire koppeling, oxidatieve capaciteit en microvasculaire functie met 'One Stop Shop' nabij-infrarood spectroscopie

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic ...