Name: focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue
Uploaded: 2011-07-06T13:00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue at JoVE.com

1. Фиксация проб и смолы вложение <ol><li> Образцы свежей ткани и клетки фиксируют, по крайней мере 2 часа в 2% параформальдегида, и 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М фосфатного буфера при рН 7,4. Размер выборки не должна превышать 0,150 мм в толщину для обеспечения адекватного проникновения или фиксатора, и не должны быть оставлены на исправление более 12 часов. </li><li> Место образцов в 20 мл флаконы сцинтилляционные стекла и промойте их в три раза, 5 минут каждая, в буфере 0,1 какодилатном. </li><li> Пятно с 1,5% (м / о) ферроцианида калия и 1% (м / о) осмия в 0,1 М какодилатном буфере (0,1 М, рН 7,4) в течение 30 минут. </li><li> Пятно с 1,0% (м / о) осмия в буфер 0,1 М какодилатном течение 30 минут. </li><li> Полоскание один раз с двойным дистиллированной воде в течение 3 минут. </li><li> Пятно с 1% (м / о) уранилацетата в бидистиллированной воде в течение 30 минут. </li><li> Промыть разделы течение 5 минут в дистиллированной воде, а затем обезвоживают в градуированных серии спирта, 2 минут каждое изменение (1 х 50%, 1 х 70%, 1 х 90%, 1 х 95%, 2 х 100%). </li><li> Добавить в возрастающих концентрациях Durcupan смолы, смешанной с этанолом, 30 минут каждое изменение, начиная с 50% Durcupan в этаноле, затем следуют: 70%, 90%, 95%, а затем 100%. </li><li> Замените свежие Durcupan и агитировать медленно в течение 4 часов. </li><li> Место разделах, используя деревянные палочки коктейль, на стекле микроскопа слайды покрытые плесенью разделяющий агент, и места в 65 ° С духовке в течение 24 часов. </li></ol> 2. Подготовка проб для FIB / SEM <ol start="11"><li> Отдельные смолы слой, содержащий образцы, с места между двумя предметными стеклами стекла микроскопа и тщательно промыть, чтобы удалить плесень разделительное средство. </li><li> Использование микроскопа проходящего света с низким целям власти, или рассечение микроскопом в проходящем освещении, для определения области интересов в рамках кусочек смолы. </li><li> Вырезать небольшой (3 мм х 3 мм) квадрат вокруг интересующей нас области использования лезвие и придерживаться этого в начало пустой блок смолы с акриловым клеем (рис. 1). Подождите 5 минут, когда клей затвердеет, а затем приступить к следующему шагу. </li><li> Зажим блока в держатель ulramicrotome и, используя прилагаемый стереомикроскопа, обрезка по всему региону, представляющие интерес с лезвием пока лишь небольшая пирамида материал остается. </li><li> Дальнейшая отделка блок, с использованием стекла нож фиксируется в ультрамикротоме, так что область интереса может быть точно расположены относительно размеров поверхности блока (рис. 1). Вырезать один край блока, близко к области интереса, так что перпендикулярно шаг прорезается образца (рис. 1 и 2). Этот шаг формы изображения лица (рис. 2). </li><li> Удалить блок из ультрамикротоме и сфотографировать области интересов в рамках блока, используя проходящем свете микроскопа. </li><li> Вырезать отделаны квартале от оставшейся смолы заглушки. Это делается с помощью видел ювелирного и гарантирует, что только небольшой блок размещается внутри FIB / SEM. Общая высота этого блока не должна быть более 5 мм. </li><li> Клей для блоков алюминия заглушки с углеродом пасты обеспечение того, чтобы стороны для включения в образ находится на внешней кромке (рис. 1). </li><li> После высыхания клея, флаг блока с тонким слоем золота (&gt; 20 нм; Крессингтон вакуумного испарения системы). </li></ol> 3. Изображений в FIB / SEM <ol start="20"><li> На малом увеличении, а с использованием вторичных электронов изображения (5 кВ, 0,5 nAmp), ориентироваться блок так, чтобы выбранной области интереса и стороны блока для включения в образ стоит перед оператором (рис. 2 в, г). </li><li> Восток блок так, чтобы лицо для включения в образ лежит параллельно фрезерные луча. Это означает, что пучок электронов ориентированы на 54 ° к этой грани (рис. 2 б). </li><li> Использование ионного тока пучка от 13 - 27 nAmps на 30 кВ удалить узкой полосы смолы с передней области для включения в образ. </li><li> Переключение в режим отраженных изображений, чтобы посмотреть в лицо фрезерованные, который перекрывает области интереса. </li><li> Использование светлый образ ссылкой микроскопии (приняты на шаг 16) и образ фрезерованные лицо найти точные области на блок для фрезерного и образ (рис. 2). </li><li> Депозит защитный слой (примерно 1 микрон) углерода (или металла), с помощью системы закачки газа в микроскоп, на поверхности блока, прежде интересующей области (рис. 2). </li><li> Использование тока 700 picoAmps, мелко мельница области блока, в котором окончательные изображения будут приняты. </li><li> Оставьте фрезерные луч полностью мельница изображения лицо, пока не фрезерные артефакты можно увидеть на лице. Полный мельницу лицо проверяется путем наблюдения изменения в каждый последующий изображения по всему полю зрения. Недостаточная фрезерные также может рассматриваться как белые полосы или «шторы» появляются Vertically в изображении. </li><li> Оставьте микроскоп для не менее 2 часов для любых тепловых изменений, чтобы рассеять. Это снижает риск того, что блок лицо будет дрейфовать во время съемки, в результате чего разрегулированные изображений. </li><li> Выберите микроскопом параметры для работы с изображениями лица серийно. Убедитесь, что электронный пучок имеет напряжение, которое является достаточно низким, чтобы только изображение очень небольшой глубине материала в блоке лицо. Это также должно быть гораздо мельче, чем толщина лица должны быть удалены. Типичные параметры для работы с изображениями в напряжении от 1,2 - 2,0 кВ с пиксельными размерами от 4 - 20 нм. Пиксель время выдержки должно быть сохранено около 10 μsecs так, чтобы общее время на мельницу лицо и приобрести одного изображения сохраняется менее 2 минут (рис. 3). </li></ol> 4. Секреты успеха Шаг 1) Убедитесь, образцы толщиной не более 150 мкм. Это даст возможность адекватного проникновения различных пятен и смолы в материал. Это может быть достигнуто путем срезов образцов с vibratome сразу после фиксации. Такая толщина подходит для тканей мозга. Другие ткани должны быть проверены для обеспечения адекватной фиксации и окрашивания. Шаг 3) образцы должны быть свободно распространены по всей решение, и не слипаются вместе, в одной части флакона в то время как этот вторичный фиксатор вводится. Это позволит обеспечить максимальное проникновение образца и уменьшить образец становится искаженной в этот процесс фиксации. Это достигается за счет мягко закрученного образцов в флакона сразу же после раствор добавляют. Шаг 15) Убедитесь, что область интереса находится непосредственно под (&lt;30 мкм) поверхности блока. Это позволит сократить количество фрезерных пучком ионов в фазе захвата изображений. Шаг 22) время сканирования ионного пучка должна быть adequte для того, чтобы все лицо визуализации полностью фрезерованные. Недостаточная фрезерные будут показаны как белые полосы, или «шторы» появляются вертикально вниз изображения лица. Шаг 26) окончательное фрезерованные лицо должно быть больше, чем лицо, что изображено. Это происходит потому, фрезерованные смолы выбрасывается из блока и redeposits на поверхности блока в непосредственной близости. Это переотложения может посягать на изображение поля зрения, и избежать, фрезерные гораздо большую площадь, чем образ. Для визуализации окно, которое составляет 20 мкм в ширину, фрезерованные кварталу превышает 30 микрон в ширину. Шаг 29) Очень важно, чтобы параметры электронного пучка таковы, что изображение создается электронами, которые возникают из только первые несколько нанометров от поверхности блока. Это acheved путем минимизации напряжения до уровня ниже 2 кВ и обеспечения того, чтобы не электроны проникают слишком далеко. Это также помогло с помощью сетки напряжение на детекторе, так что только электрон с высоких энергиях вклад в окончательное изображение. Как правило, сетки напряжение 1,3 кВ используется для визуализации напряжением 1,5 кВ. 5. Представитель Результаты: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="Рисунок 1"/> Рисунок 1. Подготовка смолы блока.) Смола встроенных корональных раздел (80 микрон) с помощью взрослого мозга крысы рассматривать в steromicroscope. Изображение наглядно показывает различные участки мозга, которые могут быть вырезаны из раздела (б) с помощью лезвие скальпеля. Здесь, 1 мм, квадрат от коры снимается и (с) застряли в пустой блок смолы. Г) смолы блок затем отделан стеклом нож устанавливается в ультрамикротоме, и как только блок был сокращен до только оставить область интереса (е), шаг, вырезанные перпендикулярно передней поверхности встроенные материала. е) Весь этот регион обрезается затем разрезается от остальной части смолы и установлен на алюминиевой заглушкой готовы к металлическим покрытием и изображений в сканирующего электронного микроскопа. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="Рисунок 2"/> Рисунок 2. Подготовка блока лицо FIB / SEM изображения.) И б) показать иллюстрации блока и край, который измельчают для создания изображения лица (указывается с черным двуглавым стрелкой). Положение ионного пучка (белый) показан параллельно изображение лица и электронного пучка (серый) показан удар лицом при 54 ° до ионного пучка. В) показан вид блока принимать с электронным пучком и полученную с использованием вторичных электронов. Вдоль этой стороне блока темные области (на рисунке показана пунктирной белой коробке) показывает, часть лица, которая была грубо молотый (показано с двойной головкойред черная стрелка), чтобы выявить основные образца. г) Когда эта область изображается только с помощью отраженных электронов встроенный ткани могут быть видны. Здесь, по всей ширине ткани встроенный раздел обозначается двуглавого белая стрелка. Шкала бар с) составляет 100 мкм. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="Рисунок 3"/> Рисунок 3. Изображений объем мозговой ткани с изотропными вокселей.) Обратный контрастность отраженных образ кварталу показывающий ультраструктуру в области головного мозга крыс. Все мембраны видны, а также крупных макромолекулярных структур. Б) в общей сложности 1600 изображений были собраны в 5 нм расстояния в результате чего изображение стек с изотропными вокселей. В) Этот стек могут быть отображены в любой плоскости, с таким же разрешением. Это изображение показывает одну синаптической связи, что изображено в плоскости ху и плоскости YZ.

<ol>
	<li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope:+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue.">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li><li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy.">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Техника FIB / SEM работ оптимально, когда область интереса не слишком велика. Верхний предел для отображаемого объем зависит от ионного пучка и область, что он может последовательно мельница неоднократно в течение многих часов. До сих пор это было сделано с участками около 60 х 60 микрон, тем не менее, работы с изображениями весь этот район не представляется возможным с соответствующим разрешением, в основном за счет фактора времени в сборе таких больших изображений. В качестве примера, 4 кх 4 к изображение с пиксель время выдержки до 10 микросекунд займет 2 минуты и 40 секунд, чтобы приобретать, и для поля зрения 60 микрон это было бы дать только размером пиксела 15 нм. Для визуализации ультраструктуры клеток и тканей, меньше размер пикселя больше подходит, обычно от 4 до 10 нм / пиксель. Для площадью 60 х 60 мкм изображение будет приобретено в 10 часов, даже если микроскоп было такой возможности. По этим причинам, микроскоп идеальным инструментом для изображения объемов порядка 10 х 10 х 10 микрон, либо значимых регионах целые клетки. Это можно легко сделать в течение 48-часового периода на образцах, которые хорошо контрастируют с этой процедурой. Пока протокол был использован главным образом с мозговой ткани, а также различных видов культивируемых клетках млекопитающих придерживаясь покровные. Тем не менее, фиксации и окрашивания процедура может быть использована со многими другими видами биологического материала, в том числе растительного сырья для производства одинаково хорошо контрастируют стеки изображения. Поэтому основным преимуществом этого метода является его способность изображения объемы с изотропными вокселей. Изображение стеки данного типа позволяют для анализа 3-й тома с помощью изображений, полученных в любой плоскости в стеке. Преимуществом этого является предоставление наблюдателю деталей изображения в изображение серии с любого направления и обеспечения большей детализации изображения (рис. 3).

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> Цианакрилатный клей </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Пройдя через микроскоп Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, Германия </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan смолы </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Швейцария </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM микроскоп (Zeiss, Энвижн 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Стекло гистологии слайдов </td><td> Menzel-Glaser, Германия </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> Стекло ножом производителя: Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, Германия </td><td></td></tr><tr><td> Стекло сцинтилляционных флаконов (20 мл) </td><td> EMS, США </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Глутаральдегид </td><td> EMS, США </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> Ювелирное видел </td><td> EMS, США </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Плесень разделительное средство </td><td> Glorex, Швейцария </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> Осмий четырехокиси </td><td> EMS, США </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Параформальдегид </td><td> EMS, США </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> Фосфаты соли для фосфатного буфера </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Швейцария </td><td> 71642 и 71496 </td></tr><tr><td> Натрий какодилатном </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Швейцария </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> Sputter Coater золотом целевой </td><td> Крессингтон, США </td><td></td></tr><tr><td> Трис базы (TBS) </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Швейцария </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ультрамикротоме: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, Германия </td><td></td></tr><tr><td> Уранилацетата </td><td> EMS, США </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue

Этот протокол описывает, как биологические образцы, такие как ткани мозга, могут быть отображены в трех измерениях, используя сосредоточены ионного пучка / сканирующем электронном микроскопе (FIB / SEM). Образцы крепятся с помощью альдегидов, тяжелых металлов использованием окрашенных четырехокиси осмия и уранилацетата. Затем они обезвоженной с алкоголем и проникли со смолой, которая затем затвердела. Использование светового микроскопа и ультрамикротоме со стеклянными ножами, небольшой блок, содержащий область интереса близко к поверхности, сделан. Блок помещается внутри FIB / SEM и ионных пучков используются для примерно мельница вертикальной плоскости вдоль одной стороны блока, близко к этому региону. Использование обратного рассеяния электронов на изображение глубинных структур, меньшей грани затем фрезеровать с ионным пучком тоньше и поверхности тщательно более тесно для определения точной области лица для включения в образ и фрезерованные. Параметры микроскопа затем установить так, чтобы лицо неоднократно измельчают, отображаемого так что последовательные изображения собираются в объеме блока. Изображение стек, как правило, содержат изотропной вокселей с размерами, небольшим 4 нм в каждом направлении. Это качество изображения в любой плоскости воспроизведения позволяет пользователю анализировать ультраструктуры клеток в любой угол обзора в пределах изображения стека.

Watch this Scientific Journal Video about Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue at JoVE.com

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Этот протокол описывает, как смола встроенных мозговой ткани могут быть подготовлены и отображается в трех измерениях сосредоточены ионного пучка, сканирующего электронного микроскопа.

Сосредоточены ионного пучка фрезерные и сканирующей электронной микроскопии ткани мозга

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Подготовка ткани мозга мыши для иммуноэлектронной микроскопии

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Генетических манипуляций мозжечка Granule нейронов<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; По изучению нейронных Морфология и миграция

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Обонятельная система как модель для изучения характера роста аксонов и морфология<em&gt; В Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Двуствольное и Концентрические Микроэлектроды для измерения внеклеточной Ion сигналов в ткани головного мозга

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

Характеризуя Многомасштабное механических свойств ткани головного мозга Использование атомно-силовой микроскопии, наезд отступы и Реологии

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Анализ мозга Митохондрии Использование последовательного Block-Face сканирующая электронная микроскопия

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Получение нечеловеческих приматов ткани головного мозга для предварительного внедрения иммуногистохимии и электронной микроскопии

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Создание, тестирование и использование селективного микроэлектродов ионов калия в срезах тканей взрослого мозга

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Доставка антител в мозг с помощью сфокусированного сканирующего ультразвука

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

Горизонтальные гиппокампа ломтики мыши мозга

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...