Name: detection of post-translational modifications on native intact nucleosomes by elisa
Uploaded: 2011-04-26T14:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA at JoVE.com

Ontwikkeling van de NU-ELISA-methode werd ondersteund door NIH subsidie ​​RO1AG023687.

1. Zoogdiercelculturen NU-ELISA kan worden uitgevoerd op alle zoogdieren celtype dat kan worden gekweekt in cultuur. Wij geven de voorkeur tot matig voor te bereiden op grote hoeveelheden van de cellen, zodat nucleosomen kunnen worden geïsoleerd in voldoende hoeveelheid om een ​​aantal identieke geladen ELISA-platen voor te bereiden, zodat testen met verschillende antilichamen (Abs). De volgende cultuur schalen bieden voldoende materiaal: Voor muis embyronic stamcellen groeien een of twee 15 cm platen van cellen zonder feeder-cellen. Voor de fibroblasten, groeien 5 tot 10 cm 15 platen tot confluentie. 2. Isolatie van Kernen Opmerking: Alle stappen zijn op ijs met pre-gekoelde buffers, behalve waar aangegeven. <ol><li> Trypsinize cellen met 3 ml trypsine per plaat, combineren, en voeg 20 ml ijskoud PBS / butyraat. Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de cellen in 10 ml PBS / butyraat en centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer in 4 ml lysis buffer met proteaseremmers (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce homogeniseren 20 slagen met type B stamper op ijs. </li><li> Centrifugeer bij 2000g gedurende 10 min bij 4 ° C. (Het supernatant bevat cytoplasma, wat niet nodig is voor dit protocol, maar het kan bewaard worden voor andere doeleinden worden indien gewenst). </li><li> Resuspendeer de pellet in 2 ml ijskoude wasbuffer C (met protease-remmers). </li><li> Laag de geresuspendeerde materiaal meer dan 5 ml 30% sucrose kussen, centrifugeer bij 2400G gedurende 5 minuten in een swingende emmer rotor. Kernen zal migreren door kussen, en het puin blijft in de interface. </li><li> Verwijder zorgvuldig alle vloeistof volume en resuspendeer de kernen in 250 ul ijskoude wasbuffer C + protease-remmers. </li></ol> 3. Isolatie van Nucleosomen door in situ Micrococcal Nuclease (MNase) Spijsvertering We maken gebruik van een procedure waarbij chromatine is in situ verteerd binnen de kernen door het inbrengen van MNase, gevolgd door een hypotone behandeling om vrij intacte nucleosomen rijden in het supernatant. <ol><li> Voeg 3 il 0,1 M CaCl 2 tot en met het monster. Zet in 37 ° C verwarmen blokkeren. Laat tot 37 ° C temperatuur te nemen. </li><li> Voeg 2 eenheden MNase (Micrococcal Nuclease, Sigma-Aldrich, opgelost in 2 units/10μl in MNase buffer), daarna voor incuberen bij 37 ° C gedurende 12 min, met frequente mixen met behulp van een pipet tip. </li><li> Voeg 6 pi van 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0 om de reactie te stoppen. Leg op het ijs. </li><li> Centrifugeer bij 2000g gedurende 4 min, gooi supernatant. Resuspendeer de pellet in 300 ui 0,2 mM Na-EDTA. Op te slaan op ijs gedurende 1 uur af en toe lichtjes pipetteren. (Deze hypotone voorwaarden vrij nucleosomen te bevrijden van de kernen). </li><li> Centrifugeer bij 3000 g gedurende 4 minuten bij 4 ° C. Sla de supernatant, die gratis nucleosomen bevat, op het ijs. </li><li> Weer resuspendeer de pellet met 300 ul 0,2 mM Na-EDTA. Op te slaan op ijs gedurende 1 uur af en toe lichtjes pipetteren. </li><li> Centrifugeer bij 3000g voor 4min bij 4 ° C. Bewaar de supernatant en combineren met de eerste supernatans van stap 5. De resulterende mononucleosome preparaten kunnen worden gealiquoteerd en opgeslagen bij -80 ° C. </li></ol> Opmerking: De hoeveelheid chromatine kan ruw worden gekwantificeerd door het meten van absorptie bij 260 nm van een 10 ul monster toegevoegd aan 990 ul van water. A 260 = 10 (na correctie voor de 1 / 100 verdunning) komt overeen met ongeveer 1mg/ml van het chromatine. Ook tijdens de bovenstaande procedure, kunnen kleine monsters worden bewaard en later geanalyseerd op hun DNA inhoud aan de kwaliteit en de omvang van MNase ontsluitingen, die vooral moeten bevatten DNA van 146 bp in lengte te controleren. Laddering is een indicatie van onvolledige MNase spijsvertering. Let op: Fig.1 bevat een schematisch overzicht van de nucleaire isolement en MNase ontsluitingen stappen. 4. Nucleosoom-ELISA (NU-ELISA) We ontdekken PTMs over fracties die inheemse intact nuclesosomes die zijn geïmmobiliseerd op 96 well ELISA microtiterplaten. Voor elk monster, maken we een serie van 2-voudige verdunningen, en deze zijn voorzien op bronnen in drievoud. <ol><li> Coat MaxiSorp plaatjes gedurende een nacht bij 4 ° C met 50 ul / putje van de nucleosomen verdund in coating buffer. Suggesties voor seriële tweevoudige verdunningen van nucleosomen worden bereid uit de bovenste rij naar de onderste rij door het toevoegen van 0,1 ug, 0,05 ug, 0.025 ug, 0,0125 ug, 0,00625 ug, 0,00313 ug, 0,00156 ug, met een coating buffer alleen (0 ug chromatine) in de bodem rij. (Opmerking: plaat dekt zijn nodig voor deze stap.) </li><li> In de ochtend was de platen 4 keer met 200 ul / putje PBS/0.5% Tween-20 bij kamertemperatuur (RT) voor een totaal van 10 minuten met een plaat wasmachine. </li><li> Blok 1 uur bij RT met 100 ul / putje PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA. </li><li> Verwijder de blokkering buffer door schudden van de omgekeerde plaat flinkboven een gootsteen. Deksel en bewaar de platen bij -20 ° C, of ​​ga direct naar de volgende stap. </li><li> Voeg 1 ° Abs in een volume van 50 ul / well verdund 1:1000 (of zoveel als nodig) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA, incuberen bij KT 1 uur op een rotator. </li><li> Spoel de platen 4 keer met 200 pl / well PBS/0.5% Tween-20 in RT en voor een totaal van 10 min in een plaat wasmachine. </li><li> Voeg mierikswortel peroxidase (HRP)-geconjugeerd 2 ° Abs, verdund 1:5000 (of zoveel als nodig) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA bij RT voor een uur op een rotator. </li><li> Spoel de platen 4 keer met 200 pl / well PBS/0.5% Tween-20. Elke wasbeurt is bij kamertemperatuur en voor een totaal van 10 minuten met een plaat wasmachine. </li><li> Ontwikkelen van de platen door het toevoegen van 50 pi van TMB substraat aan elk goed voor 10 min bij RT. Stop de reactie door toevoeging van 50 ul / putje van 2N H 2 SO 4 en lees de platen 450 nm. (Tip: Centrifugeer bij 1500 rpm gedurende 2 minuten met behulp van een plaat rotor om eventuele luchtbellen in de putjes verdwijnen voorafgaand aan het lezen van absorptie). </li><li> Exporteer de metingen te spreadsheet bestanden voor kwantitatieve en statistische analyses. </li></ol> Reagentia <table border="1"><tbody><tr><td> PBS / butyraat </td></tr><tr><td> 135 mM NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td></tr><tr><td> 8 mM Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1,5 mM KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butyraat </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Lysis Buffer </td></tr><tr><td> 250 mM sucrose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butyraat </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,1% Triton X-100 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Wasbuffer C </td></tr><tr><td> 250 mM sucrose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butyraat </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Sucrose Kussen </td></tr><tr><td> 30% (w / v) sucrose in wasbuffer C </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Microccocal Nuclease Buffer </td></tr><tr><td> 5 mM NaPO 4 Buffer, pH 7,0 </td></tr><tr><td> 0,025 mM CaCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Coating buffer </td></tr><tr><td> 80 ml ​​Oplossing A + 170ml Oplossing B + 250ml dH 2 O </td></tr><tr><td> Oplossing A: 0,2 M Na 2 CO 3 </td></tr><tr><td> Oplossing B: 0.2 M NaHCO 3 </td></tr></tbody></table> 5. Representatieve resultaten Met behulp van de NU-ELISA methode, een reeks van verschillende identieke platen zijn bereid die kunnen worden geladen met chromatine opgesteld in de vorm van mononucleosomes. We meestal voor te bereiden serie van identiek-geladen platen, zodat elke kan worden afgetast met verschillende anti-PTM specifieke antilichamen (ABS). We hebben ook altijd voor te bereiden een plaat die kan worden gemerkt met een Ab die histon-eiwitten detecteert zonder te letten op hun wijziging staat in totaal chromatine het laden van controle. Deze controle is essentieel om later kwantitatief vergelijken PTM inhoud van de nucleosomen bereid uit verschillende monsters. Om kwantificeren de niveaus van PTMs binnen een bepaalde chromatine monster corrigeren we de ruwe absorptie waarden met behulp van deze aanpak: Ten eerste, trekken we elke achtergrond signaal met behulp van waarden die zijn verkregen van de controle putjes die geen chromatine (achtergrond is meestal te verwaarlozen). Vervolgens hebben we standaardiseren PTM-specifieke signalen naar NU-ELISA-resultaten van een identiek geladen plaat die werd getest met een Ab die nucleosomen onafhankelijk van hun wijziging staat detecteert. (We hebben polyklonale Abs specifiek voor histonen H2A H2B of voor dit doel). Vervolgens bepalen wij de middelen en varianties voor elke verdunning van chromatine en de gegevens die zijn verkregen uit het lineaire gedeelte van de ELISA-test. Gedetailleerde voorbeelden van NU-ELISA wiskundige en statistische analyses zijn eerder vier gemeld <img src="/files/ftp_upload/2593/2593fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Schematische diagam van de NU-ELISA stappen. A. zoogdiercellen zijn geoogst; B. Kernen worden gescheiden van de cellen door Dounce homogenization, C. Verstoorde cellen worden geladen op de top van een 30% w / v sucrose kussen, D. Na centrifugeren, worden kernen afgezet in de pellet, E, F. chromatine worden verteerd in situ overwegend mononucleomes door MNase, G, H , ik. Oplosbare mononucleosomes worden geëxtraheerd door hypotone behandeling en herhaaldelijk centrifugeren van de resterende nucleair materiaal. J. Mononucleosomes uit verschillende monsters (het label samp. 1 en 2 in dit geval) zijn bekleed microtiterputjes in serie van identiek-geladen platen en ondervraagd met PTM-specifieke Abs en PTM-onafhankelijke Abs aan de totale chromatine belasting te bepalen. K. Voorstelling van differentiële signaal detectie niveaus in twee steekproeven die verschillen in hun PTM inhoud, maar hebben soortgelijke algemene chromatine-inhoud, zoals beoordeeld door de anti-H2B immunoreactiviteit.

<ol>
	<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+the+histone+code.">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li><li>Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+an+epigenetic+code.">Histone acetylation and an epigenetic code.</a> Bioessays. 22, 836-845 (2000).</li><li>Dai, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epiproteomic+signatures+distinguish+embryonic+stem+cells+from+differentiated+cells.">Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells.</a> Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).</li><li>Tanasijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+accumulation+of+epigen+etic+heterogeneity+during+human+ES+cell+culture.">Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture.</a> Epigenetics. 4, 330-338 (2009).</li><li>Thomas, J. O., Gould, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+fractionation+of+chromatin+and+linker+histones.">Isolation and fractionation of chromatin and linker histones.</a> Chromatin: a practical approach. , 12-14 (1998).</li><li>Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Gould, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+separation+of+core+histones+and+non-histone+chromosomal+proteins.">Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins.</a> Chromatin: a practical approach. , 38-39 (1998).</li></ol>

NU-ELISA is een methode om de wereldwijde status van nucleosoom PTMs aanwezig in een bepaald celtype vast te stellen. NU-ELISA studies hebben aangetoond dat de wereldwijde nucleosoom wijziging verklaart verschillen in vergelijkingen van verschillende celtypen 4. Daarnaast, NU-ELISA PTM-profielen te wijzigen wanneer de cellen worden blootgesteld aan epigenetische modulerende middelen zoals trichostatine-A of wanneer de muis embyronic stamcellen zijn gedifferentieerd 4. De methode is ook met succes toegepast op de chromatine van menselijke embryonale stamcellen 5 studiepunten. Het is belangrijk op te merken van de NU-ELISA, in de huidige vorm, kan alleen de composiet handtekening van PTMs aanwezig in de totale som van de cellulaire epigenoom op te sporen. Dit verschilt duidelijk van genoom-brede chromatine immunoprecipitatie, die de verdeling van een specifieke PTM over specifieke genetische loci kan bepalen. De eerste stappen van de NU-ELISA procedures worden aangepast van bovenstaande methoden om mononucleosomes isoleren van zoogdieren kernen 6,7. Deze aangepaste methoden geven een doelmatige manier om de hoge kwaliteit intact mononucleosomes te verkrijgen van zoogdiercellen, en de daaruit voortvloeiende fracties zijn uitgebreid in de chromatine inhoud, maar bevatten een veel extra nucleair materiaal. Aangezien de specifieke Abs worden gebruikt, is niet-vervuilende nucleosomale materiaal goed wordt verdragen in de NU-ELISA-test, in tegenstelling tot de massa-spec benaderingen die grotere zuiverheid nodig hebben. Echter, NU-ELISA is gevoeliger en kwantitatieve dan western blotting 4, en zo goede alternatieven voor westerns en de massa spec voor de detectie van nucleosomale PTMs.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Micrococcal Nucleae </td><td> Sigma </td><td> N3755 </td><td> Maak fracties van 2 U/10μl buffer, opgeslagen bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Nunc MaxiSorp microtiterplaten </td><td> Visser </td><td> 12-565-135 </td><td> Zelfklevende plaat dekt kunnen ook besteld worden door middel van Fisher </td></tr><tr><td> Geautomatiseerde plaatwasser </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1-Step TMB-ELISA substraat </td><td> Doorboren </td><td> 34028 </td><td> Bewaren bij 4 ° C voor te verwarmen om RT vóór gebruik of zoals aangegeven op het specificatieblad </td></tr><tr><td> Microtiterplaat Reader </td><td> Bio-Rad microplaat reader (model: 680) </td><td></td><td> De meeste colorimetrische plaat lezer modellen zijn geschikt </td></tr></tbody></table>

detection of post-translational modifications on native intact nucleosomes by elisa

Het genoom van eukaryoten bestaat als chromatine die zowel DNA en eiwitten bevat. De fundamentele eenheid van chromatine is het nucleosoom, die 146 basenparen van DNA geassocieerd met twee elk van de histonen H2A, H2B, H3, H4 en 1 bevat. De N-terminale staarten van histonen zijn rijk aan lysine en arginine en zijn post-transcriptioneel gemodificeerd door acetylering, methylering, en andere post-translationele modificaties (PTMs). De PTM configuratie van nucleosomen kan invloed hebben op de transcriptionele activiteit van het DNA, en zo een manier van genregulatie dat epigenetische in de natuur 2,3. We ontwikkelden een methode genaamd nucleosoom ELISA (NU-ELISA) voor het kwantitatief bepalen wereldwijde PTM handtekeningen van nucleosomen uit cellen. NU-ELISA is gevoeliger en kwantitatieve dan western blotting, en is handig om het epiproteomic staat van specifieke celtypen te ondervragen. Deze video tijdschriftartikel toont gedetailleerde procedures uit te voeren NU-ELISA-analyse.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA at JoVE.com

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Nucleosoom ELISA (NU-ELISA) is een gevoelige en kwantitatieve methode om de wereldwijde patronen van post-translationele modificaties te detecteren in de voorbereiding van de inheemse, intacte nucleosomen. Deze wijzigingen zijn onder methylations, acetyleringen en fosforylaties op specifieke histon aminozuur residuen, en dus NU-ELISA geeft een globaal proteomics analyse van de totale chromatine modificatie staten van specifieke celtypen.

Detectie van post-translationele modificaties op native Intact Nucleosomen door middel van ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Detectie van Functionele matrix metalloproteinasen door zymografie

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Het analyseren van de functie van kleine GTPases door micro-injectie van Plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Detectie van histon Wijzigingen in bladeren

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Ontluikende Gist Protein extractie en zuivering voor de Studie van de functie, interacties, en post-translationele modificaties

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection van stikstofoxide en superoxide in endotheellaag van Intact slagaders

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

High-throughput CRISPR Vector Constructie en karakterisering van DNA Wijzigingen van Generation van Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Vergelijking van de Tabak Host Cell Protein methode voor het verwijderen van blancheren intacte planten of door een warmtebehandeling van Extracten

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...