Name: derivation of thymic lymphoma t-cell lines from atm-/- and p53-/- mice
Uploaded: 2011-04-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Boris Reizis do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade de Columbia para discussões úteis. Gostaríamos também de agradecer ao Dr. Margaret Bynoe, Dr. Rodman Getchell e Deequa Mahamed do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina Veterinária, da Universidade Cornell de assistência técnica com citometria de fluxo e Lu Huang para obter ajuda com edição de vídeo. Os autores também desejam agradecer aos membros do Duhamel e laboratórios Weiss para a sua revisão crítica do manuscrito e produção de vídeo, e Stephanie Yazinski do laboratório Weiss para reprodução e genotipagem p53 - / - ratos. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Cornell University Animal Care Institucional e Comitê de uso. Esta pesquisa foi suportada em parte por fundos fornecidos pelo Departamento de Agricultura dos EUA, Pesquisa do Estado de Cooperativa, Educação e Serviço de Extensão da Saúde Animal, e Programa de Pesquisa de Doenças (para GED e RSW) e subvenções NIH R03 HD058220 e R01CA108773 (para RSW). O vídeo foi produzido usando in-house instalações pelo pessoal dos laboratórios Duhamel &amp; Weiss.

1. Dissecação de Tumor <ol><li> Para dissecção do tumor, uma toalha de papel ou panos cirúrgicos descartáveis ​​é colocado na plataforma de dissecção e pulverizadas com etanol 70%. </li><li> Camundongos para este protocolo são rotineiramente submetidos à eutanásia com CO 2. Posicione o mouse sacrificados no teclado dissecção e spray de ambos os lados do animal com o etanol. O mouse é mantida no lugar sobre o bloco dissecção por meio de quatro ou mais alfinetes inseridos através das per...

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	<li>Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm-deficient+mice:+a+paradigm+of+ataxia+telangiectasia.">Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia.</a> Cell. 86, 159-171 (1996).</li><li>Elson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+defects+in+ataxia-telangiectasia+protein-deficient+mice.">Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).</li><li>Kuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Atm-/-+thymic+lymphoma+cell+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+by+dexamethasone.">Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).</li><li>Browne, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+a+catalytic+antioxidant+corrects+the+neurobehavioral+defect+in+ataxia-telangiectasia+mice.">Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice.</a> Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).</li><li>Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spectrum+analysis+in+p53-mutant+mice.">Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice.</a> Curr Biol. 4, 1-7 (1994).</li><li>Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+T+cell+leukemia+cell+lines+established+from+SCL/LMO1+double+transgenic+mice.">Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice.</a> Leukemia. 15, 141-147 (2001).</li><li>Sharma, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+contributes+to+mouse+T-cell+leukemia+by+directly+inducing+the+expression+of+c-myc.">Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc.</a> Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).</li><li>Maser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomally+unstable+mouse+tumours+have+genomic+alterations+similar+to+diverse+human+cancers.">Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers.</a> Nature. 447, 966-971 (2007).</li></ol>

Neste protocolo, nós fornecemos os procedimentos detalhados para estabelecer murino de células T linhas de dois genótipos diferentes do mouse; Atm - / - [FVB/N- Atm tm1Led / J] p53 e - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . Usando esse protocolo, um total de 6 (de 7 tentativas) Atm - / - e três (de 5 tentativas) p53 - / - murino de células T linhas foram estabelecidas em nosso laboratório. Dad...

<ul><li> Balde de gelo </li><li> Etanol 70% </li><li> Pad dissecção consistindo de bloco de espuma coberto com papel alumínio e pinos </li><li> Dois conjuntos de pequenas tesouras e pinças esterilizadas, </li><li> Estéril 150 milímetros 2 Placa de Petri (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA;. Cat # 08-757-13) </li><li> 18 agulhas estéreis </li><li> 50 mL tubos cônicos (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829) </li><li> 10% de formalina tamponada </li><li> Cultura de tecidos frascos <ul><li> T-25 (TPP, Trasadingen, Suíça; cat # 90025) </li><li> T-75 (TPP, Trasadingen, Suíça; cat # 90075) </li></ul></li><li> 6-lamelas (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506) </li><li> Fosfato estéril tamponada pH 7,2 solução salina (PBS) </li><li> Meio de cultura <ul><li> RPMI 1640 com 25 HEPES mM, 200 mM L-glutamina (Lonza, Walkersville, MD; gato # 12-115F), suplementado com o seguinte: <ul><li> Calor de 10% inativado (56 ° C, 30 min) de soro fetal bovino (FBS; Hyclone, Logan, UT; # cat SH30088.03) </li><li> 1% de penicilina e estreptomicina (Mediatech, Manassas, VA; gato # 30-002-CI) </li><li> 1% aminoácidos não essenciais (Mediatech; gato # 25-025-CI) </li><li> 55 mM 2β-mercaptoetanol (Sigma, St Louis, MO; cat # M752) </li></ul></li></ul></li><li> Dimetil sulfóxido (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275) </li><li> Anticorpos (eBioscience, San Diego, CA) <ul><li> anti-CD3-FITC (cat. # 11-0031-85) </li><li> anti-CD4-APC (cat. # 17-0041-83) </li><li> anti-CD8-PE (cat. # 12-081-85) </li></ul></li><li> Albumina sérica bovina (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY;. Cat # 11018-017) </li><li> Concanavalina A (Sigma cat # C5275) </li><li> 1,8 mL frascos de congelamento (Nunc, Roskilde, na Dinamarca; cat # 368632) </li></ul>

derivation of thymic lymphoma t-cell lines from atm-/- and p53-/- mice

As linhas celulares são uma ferramenta de pesquisa fundamental que pode reduzir o uso de animais de laboratório em pesquisa. Certas cepas de camundongos geneticamente modificados, tais como ATM - / - e p53 - / - consistentemente desenvolver linfoma tímico no início da vida 1,2, e, portanto, pode servir como uma fonte confiável para a derivação de células T murino linhas. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para o desenvolvimento do timo murino estabelecida linfoma de células T linhas sem a necessidade de adicionar interleucinas, conforme descrito nos protocolos anteriores 1,3. Tumores foram colhidas de camundongos com idade entre três a seis meses, na primeira indicação de tumores visíveis a partir da observação da postura arqueada, trabalhou preparação respiração, pobres e desperdício em um 1,4 linhagem suscetível. Nós temos estabelecido com sucesso várias linhas de células T usando este protocolo e de estirpes puras e Atm - / - [FVB/N- Atm tm1Led / J] 2 e p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 camundongos. Nós ainda demonstram que mais de 90% do estabelecido população de células T CD3 expressa, CD4 e CD8. Consistente com linhas de células de maneira estável estabelecida, as células-T gerados usando o protocolo presentes foram várias passagens por mais de um ano.

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Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Neste vídeo mostramos um protocolo para estabelecer linhagens de células do timo de rato linfoma. Ao seguir este protocolo, conseguimos estabelecer várias células T linhas de Atm-/ - e p53-/ - ratos com linfoma tímico.

Derivação de Tímico linfoma de células T Linhas de Atm - / -</sup E<emP53> - / -</sup Ratos

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Ratos Transnuclear com pré-definidos T Especificidades receptor da célula contra a Toxoplasma gondii Obtidos Via TNCS

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Imunologia e Infecção

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Exame de seleção positiva e negativa Tímico por citometria de fluxo

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

O transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células T CD4 alogênico em camundongos

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivação de células T<em&gt; In Vitro</em&gt; De Mouse Células-Tronco Embrionárias

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Preparação e Aplicações de culturas organotípicas Tímico Fatia

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Derivação de Tímico linfoma de células T Linhas de Atm - / - E - / - Ratos

Derivação de Tímico linfoma de células T Linhas de Atm^{- / - E^{- / - Ratos}}