Name: derivation of thymic lymphoma t-cell lines from atm-/- and p53-/- mice
Uploaded: 2011-04-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Boris Reizis från Institutionen för mikrobiologi och immunologi vid Columbia University för bra diskussioner. Vi vill också tacka Dr Margaret Bynoe, Dr Rodman Getchell och Deequa Mahamed från institutionen för mikrobiologi och immunologi vid College of Veterinary Medicine, Cornell University för tekniskt bistånd med flödescytometri och Lu Huang för hjälp med videoredigering. Författarna vill också tacka ledamöterna i Duhamel och Weiss laboratorier för deras kritiska granskning av manuskriptet och videoproduktion, och Stephanie Yazinski från Weiss laboratoriet för avel och genotypning p53 - / - möss. Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Cornell University Institutional Animal Care och användning kommittén. Denna forskning stöds delvis av medel från US Department of Agriculture, kooperativa staten forskning, utbildning och Extension Service, djurhälsa och Disease Research Program (till GED och RSW) och NIH bidrag R03 HD058220 och R01CA108773 (till RSW). Videon producerades med hjälp av in-house anläggningar av personal från Duhamel &amp; Weiss laboratorier.

1. Dissekering av tumör <ol><li> För tumör dissektion, är en ren pappershandduk eller disponibel kirurgiska drapera placeras på dissekering pad och besprutas med 70% etanol. </li><li> Möss för detta protokoll rutinmässigt avlivas med CO 2. Placera euthanized musen på dissekering pad och spraya båda sidor av djur med etanol. Musen hålls på plats på dissektion plattan med hjälp av fyra eller fler driva stift in genom ben och sprutade noggrant med 70% etanol. </li><li> Huden över mittlinjen skä...

<ol>
	<li>Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm-deficient+mice:+a+paradigm+of+ataxia+telangiectasia.">Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia.</a> Cell. 86, 159-171 (1996).</li><li>Elson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+defects+in+ataxia-telangiectasia+protein-deficient+mice.">Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).</li><li>Kuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Atm-/-+thymic+lymphoma+cell+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+by+dexamethasone.">Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).</li><li>Browne, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+a+catalytic+antioxidant+corrects+the+neurobehavioral+defect+in+ataxia-telangiectasia+mice.">Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice.</a> Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).</li><li>Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spectrum+analysis+in+p53-mutant+mice.">Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice.</a> Curr Biol. 4, 1-7 (1994).</li><li>Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+T+cell+leukemia+cell+lines+established+from+SCL/LMO1+double+transgenic+mice.">Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice.</a> Leukemia. 15, 141-147 (2001).</li><li>Sharma, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+contributes+to+mouse+T-cell+leukemia+by+directly+inducing+the+expression+of+c-myc.">Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc.</a> Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).</li><li>Maser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomally+unstable+mouse+tumours+have+genomic+alterations+similar+to+diverse+human+cancers.">Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers.</a> Nature. 447, 966-971 (2007).</li></ol>

I detta protokoll, vi tillhandahåller detaljerade förfaranden för att upprätta murin T-cellinjer från två olika möss genotyper, ATM - / - [FVB/N- Atm tm1Led / J] och p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . Genom att använda detta protokoll, totalt 6 (av 7 försök) ATM - / - och tre (av 5 försök) p53 - / - murin T-cellinjer har fastställts i vårt laboratorium. Representativa uppgifter som vi...

<ul><li> Ishink </li><li> 70% etanol </li><li> Dissektion pad består av skumblock täckt med aluminiumfolie och stift </li><li> Två uppsättningar av små steril sax och pincett </li><li> Sterila 150 mm 2 petriskål (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,. Katten # 08-757-13) </li><li> Sterila 18 gauge nålar </li><li> 50 ml koniska rör (Corning Inc. Corning NY, katt # 430.829) </li><li> 10% buffrad formalin </li><li> Vävnadskultur kolvar <ul><li> T-25 (TPP, Trasadingen, Schweiz, katt # 90.025) </li><li> T-75 (TPP, Trasadingen, Schweiz, katt # 90.075) </li></ul></li><li> 6-brunnars plattor (Corning Inc. Corning NY, katt # 3506) </li><li> Steril fosfatbuffrad koksaltlösning pH 7,2 (PBS) </li><li> Odlingsmedium <ul><li> RPMI 1640 med 25 mm HEPES, 200 mm L-glutamin (Lonza, Walkersville, MD, katt # 12-115F) kompletteras med följande: <ul><li> 10% värmeinaktiverad (56 ° C, 30 min) fetalt bovinserum (FBS, Hyclone, Logan, UT, katt # SH30088.03) </li><li> 1% penicillin och streptomycin (Mediatech, Manassas, VA, katt # 30-002-CI) </li><li> 1% onödiga aminosyror (Mediatech, katt # 25-025-CI) </li><li> 55 mm 2β-merkaptoetanol (Sigma, St Louis, MO, katt # M752) </li></ul></li></ul></li><li> Dimetylsulfoxid (DMSO, Calbiochem, La Jolla, Kalifornien, katt # 317.275) </li><li> Antikroppar (eBioScience, San Diego, CA) <ul><li> anti-CD3-FITC (kat. # 11-0031-85) </li><li> anti-CD4-APC (kat. # 17-0041-83) </li><li> anti-CD8-PE (kat. # 12-081-85) </li></ul></li><li> Bovint serumalbumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY,. Katten # 11.018-017) </li><li> Concanavalin A (Sigma katt # C5275) </li><li> 1,8 mL frysning flaskor (Nunc, Roskilde, Danmark, katt # 368.632) </li></ul>

derivation of thymic lymphoma t-cell lines from atm-/- and p53-/- mice

Etablerade cellinjer är en kritisk forskning verktyg som kan minska användningen av försöksdjur i forskning. Vissa stammar av genetiskt modifierade möss, som ATM - / - och p53 - / - utvecklar ständigt thymic lymfom tidigt i livet 1,2, och därmed kan fungera som en tillförlitlig källa för härledning av murina T-cellinjer. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för utveckling av etablerade murina thymic lymfom T-cellinjer, utan att behöva lägga interleukiner som beskrivs i tidigare protokoll 1,3. Tumörer skördades från möss i åldrarna tre till sex månader, vid första tecken på synliga tumörer bygger på observationer av krökt kroppshållning, ansträngd andning, dålig grooming och slösa i en känslig stam 1,4. Vi har framgångsrikt etablerat flera T-cellinjer med hjälp av detta protokoll och inavlade stammar av ATM - / - [FVB/N- Atm tm1Led / J] 2 och p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 möss. Vi visar vidare att mer än 90% av de etablerade T-cells befolkningen uttrycker CD3, CD4 och CD8. I överensstämmelse med stabilt etablerade cellinjer, har T-celler som genereras med hjälp av detta protokoll har passerats i över ett år.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice at JoVE.com

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

I denna video visar vi ett protokoll för att upprätta mus thymic linjer lymfom cell. Genom att följa detta protokoll, har vi framgångsrikt etablerat flera T-cellinjer från ATM-/ - och p53-/ - möss med thymic lymfom.

Härledning av thymic Lymfom T-cellinjer från Atm - / -</sup Och P53 - / -</sup Möss

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Möss med fördefinierade Receptor T cellspecifika Against Toxoplasma gondii Erhållits via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Undersökning av thymus Positiv och negativ selektion genom flödescytometri

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation av Tail Hud att Studera Allogen CD4 T-cellsvar hos möss

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Härledning av T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Från Mouse embryonala stamceller

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naiv CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering i T cellundergrupper

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral Transduction av benmärgsstamceller för att generera T-cellreceptor Retrogenic Möss

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Förberedelse och tillämpningar av Organotypic Thymic Slice kulturer

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Mätning av T-cell alloreaktivitet Använda Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

En effektiv och enkel metod för att fastställa NK och T cellinjer från patienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfektion

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Härledning av thymic Lymfom T-cellinjer från Atm - / - Och P53 - / - Möss

Härledning av thymic Lymfom T-cellinjer från Atm^{- / - Och P53^{- / - Möss}}