Name: whole cell recording from an organotypic slice preparation of neocortex
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex at JoVE.com

Författarna vill tacka Mayumi Sakuraba och Rebecca Foehring för enastående tekniskt bistånd. Dessutom vill vi tacka Dr. Rodrigo Andrade för att få hjälp med att genomföra organotypic slice kultur och biolistic protokoll transfektion och Dr Jeanne Nerbonne för att förse oss med cDNA konstruktioner för transfektion. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag: NS044163 från NINDS (för RCF).

1. Förberedelser före den dag då Skivning Vi tycker att det är mer effektivt att autoklaveras kirurgiska instrument och förbereda lösningar före dagen för skivning. <ol><li> Autoklav instrument. (Den kirurgi och skivning sker under semi-sterila förhållanden). Autoklav följande paket, individuellt förpackade i autoklav papper: <ul class="none"><li> Kirurgi paket: spatel, # 22 skalpell blad handtag, sax, pincett </li><li> Skivning paket: 3 vred (...

<ol>
	<li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex.">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li><li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices.">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li><li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex.">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li><li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons.">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+of+neural+tissue.">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue.">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li><li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones.">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li><li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons.">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li><li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons.">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li><li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes.">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li><li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices.">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li><li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+rectifier+K++currents,+IK,+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons.">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li><li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun:+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue.">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons.">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li><li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons.">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun.">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li><li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons.">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li><li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li></ol>

Vi har studerat uttrycket och funktionella roller spänningskänsliga kaliumkanaler i pyramidala neuron från råtta neocortex (4, 9-11). På grund av bristen på specifika farmakologiska medel för dessa kanaler, använder vi en genetisk metod för att manipulera kanal uttryck (1,14,15,17-19). Vi använder en organotypic kultur förberedelse (2,3, 5-8, 12,13,15-22). Ändras från den strategi Stoppini et al (16), i syfte att upprätthålla cellmorfologin och laminära mönster av cortex. Vi isolerar a...

Kirurgi / transfektion / kultur: <ol><li> Brain Slicer: Campden Vibroslice # MA572 World precisionsinstrument, Sarasota, FL, USA </li><li> Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94.547) <ul><li> Inkluderar: Gene pistol, helium slangpaket med regulator, slangar prep station (# 165-2418), spruta kit, Tefzel rör, slangar kutter, optimering kit (# 165-2424), slang cutter </li><li> Bio-Rad Helium Regulator (# 165-2413) </li><li> engångsutrustning för Helios från Bio-Rad: <ul><li> 1,6 ìm Guld Microcarriers: # 165-2264 </li><li> Tefzel Slangar: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> Inkubator: Forma vetenskaplig modell # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766). </li></ol> Media: <ol><li> Häst Serum: Hyclone donator häst # SH 30.074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84.321) </li><li> HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS och HEPES, ingen glutamin: Lonza BioWhittaker Catalog # 12-137F): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, alternativ 1. </li><li> HBSS (GIBCO Hanks saltlösning, # 24.020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, alternativ 1. </li><li> MEM (GIBCO minimal viktigt medium, # 12.360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, alternativ 1. </li><li> 250 ml Millipore 0,2 ìm filter: # SC6PU02RE </li><li> Plast överföringspipetter: Fisher # 13-711-20. </li><li> 50 ml Millipore steriflip 0,22 ìm filter (# SCGP00525) </li></ol> Objekt 6-8 av: Fisher Scientific, 1241 ambassadör Blvd, PO Box 14.989, St Louis, MO 63.132. Inspelning: <ol><li> Pipettera glas: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparater, 84 oktober Hill Road, Holliston, Massachusetts 01.746 </li><li> Sutter P-87 horisontella elektrod avdragare: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94.949 </li><li> Axon Instruments Multiclamp 700B förstärkare: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94.089-1136 </li><li> PClamp 10 datainsamling programvara: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94.089-1136 </li><li> lectrode position kontrolleras med Sutter ROE-200 manipulatorer och PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94.949. </li><li> Mikroskop: Olympus BX-50WI upprätt mikroskop med IR-DIC optik </li><li> IR-känsliga kameran OLY-150 (Olympus) eller DAGE-HIM (DAGE-HIM, 01 North Roeske Avenue, Michigan City, IN 46.360). </li></ol>

whole cell recording from an organotypic slice preparation of neocortex

Vi har studerat uttrycket och funktionella roller spänningskänsliga kaliumkanaler i pyramidala neuron från råtta neocortex. På grund av bristen på specifika farmakologiska medel för dessa kanaler har vi tagit en genetisk strategi för att manipulera kanal uttryck. Vi använder en organotypic kultur förberedelse (16) för att upprätthålla cellmorfologin och laminära mönster av cortex. Vi isolerar vanligtvis akut hjärnbarkens skivor på postnatal dagar 8-10 och underhålla skivor i kultur för 3-7 dagar. Detta ger oss möjlighet att studera nervceller vid samma ålder med dem i vårt arbete med akut skivor och minimerar utvecklingen av översvallande excitatoriska anslutningar i segmentet. Vi spela in från visuellt identifierade pyramidformade nervceller i lager II / III eller V med hjälp av IR-belysning (IR-) och differential interferens kontrast mikroskopi (DIC) med hela cell patch clamp i ström-eller spännings-klämma. Vi använder biolistic (Gene pistol) transfektion av vildtyp eller mutant kaliumkanal DNA att manipulera uttrycket för kanalerna för att studera deras funktion. De transfekterade cellerna är lätt identifieras av epifluorescence mikroskopi efter samtidigt transfektion med cDNA för grönt fluorescerande protein (GFP). Vi jämför inspelningar av transfekterade celler till angränsande, untransfected nervceller i samma lager från samma skiva.

Watch this Scientific Journal Video about Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex at JoVE.com

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Detta är ett protokoll för att förbereda och upprätthålla en hjärnbarkens skiva beredning i organotypic kulturen för att göra elektriska inspelningar från pyramidala nervceller.

Hela Cell Spela in från en Organotypic Slice Beredning av neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Organotypic Slice Kultur av GFP-uttryckande musembryon i realtid avbildning av perifera nerver utväxt

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Skiva Förberedelse, Organotypic Tissue odling och luciferas Inspelningen av Clock geners aktivitet i suprachiasmatiska Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic hippocampus Slice kulturer

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

En Organotypic Slice-analys för högupplöst Time-lapse avbildning av neuronala migration i Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Analysen av Purkinje Cell Dendritic Morfologi i Organotypiska slice kulturer

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Samtidiga Hel-Inspelningar från fotoreceptorer och andra ordningens neuron i ett Amfibie näthinnan Slice Förberedelser

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic Slice kulturer för att studera Oligodendrocyte Dynamics och myelinisering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Kopplade Hela Cell Inspelningar i Organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic Hippocampus Slice kulturer som en modell att studien neuroprotektion och invasivitet av tumörceller

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Beredning av akut ryggmärgen skivor för hela-cell Patch-clamp inspelning i Substantia Gelatinosa nervceller

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...