Name: a 1.5 hour procedure for identification of enterococcus species directly from blood cultures
Uploaded: 2011-02-10T20:00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures at JoVE.com

Исследования были авторами которого AdvanDx.

1. Коллекция образцов и подготовка <ol><li> Сбор венозной крови от пациентов с подозрением на сепсис и поставить на два BACTEC (BD, Sparks, MD) бутылки посев крови, один аэробных и анаэробных один, а в составе одного крови культуре множество. </li><li> Место бутылок в 9240 BACTEC инструментом при температуре 35 ° C. </li><li> Инкубируйте пока прибор срабатывает сигнал тревоги в связи с ростом организмов в бутылке культуры крови. </li><li> Удалите бутылку из инструмента культуры крови. </li></ol> 2. Подготовка реагентов До окрашивания <ol><li> Подготовка промывочного раствора путем добавления 4 мл 60x промывочного раствора затем 240 мл свежей деионизированной или дистиллированной воды непосредственно к Окрашивание антенны. </li><li> Положите окрашивания блюдо в 55 ° С водяной бане до теплого. </li><li> Храните оставшийся концентрат на 2-8 ° C. </li><li> Удалить Монтаж Средний из холодильника и нагреться до комнатной температуры. </li></ol> 3. Грамм окрашивания <ol><li> Аккуратно водоворот бутылка крови культуры. </li><li> Использование игл и шприцев или субкультивирования аппарата, удаления крови (приблизительно 5 мл) из бутылки и поместить в стерильный винт ограничен трубки. </li><li> Использование стерильной пипетки, место одной большой капли крови на микроскопический слайд стекла. </li><li> Воздух сухой слайд и исправить в метаноле в течение 10 секунд. </li><li> Разрешить слайд высохнуть на воздухе. </li><li> Выполните по Граму мазке крови, чтобы определить морфологию организма растет в бутылке культуры крови. </li><li> Использование линз нефти погружения, просматривать слайд. Грамположительные кокки в парах и короткие цепочки наблюдается на Граму является наиболее соответствует энтерококков видов. </li><li> Это Граму результат затем проходит выбор надлежащего комплекта FISH зонда ПНА использовать для бактериальных идентификации. Эта кровь культуры будет окрашивали Е. фекальный / OE ПНА FISH пятно. </li></ol> 4. ПНА FISH пятно <ol><li> Смешайте трубки, содержащей кровь мягко закрученной до мазка подготовки. </li><li> Поместите одну каплю Фиксация Решение о яме стекло микроскопа FISH ПНА. </li><li> Передача 10 мкл или одна маленькая капля из трубки с положительной культуры крови к фиксации решения и аккуратно перемешать для эмульгирования. </li><li> Fix мазков при помощи их нагревания в течение 20 мин. при 55 ° С на нагревательной пластине. </li></ol> 5. Материал контроля качества Одним из положительных и один отрицательный слайд контроля качества должны быть проверены с каждой серией слайдов для окрашивания. <ol><li> Используйте Е. фекальный / OE управления Слайды приобрести у AdvanDx для этой цели или готовить мазки из жидкой культуры ведения штаммов E. фекальный и E. faecium в качестве положительного контроля либо на отдельных слайдов или смешанный на один слайд и бактерии рода стафилококки или стрептококки, как негативного материала управления. </li></ol> Результаты контроля качества должны быть в состоянии контролировать соответствующие условия для тестирования, особенно те, которые затрагивают строгости гибридизации и проникновения клеточной стенки, так как ПНА методология призвана оптимизировать проникновение клеточной стенки 6. Гибридизация <ol><li> Добавьте одну каплю Е. фекальный / OE ПНА хорошо на предметное стекло с мазком. </li><li> Добавить покровное. Избегайте воздушных пузырьков. </li><li> Инкубировать 30 ± 5 мин. при 55 ± 1 ° С при нагреве пластины </li><li> После инкубации место слайдов в слайд перевозчика </li></ol> 7. Строгие Вымойте <ol><li> Погрузите перевозчика слайда в разогретой промывочного раствора при 55 ° С и тщательно удалить покровное. Часто, покровное соскальзывает, осторожно агитацию слайда в промывочного раствора. Иногда, покровное должно быть мягко оттолкнулся щипцами. </li><li> Инкубируйте в промывочного раствора в течение 30 ± 5 мин. при 55 ± 1 ° C. </li><li> Удалить слайды из промывочного раствора </li><li> Разрешить слайд высохнуть на воздухе </li></ol> 8. Монтаж <ol><li> Добавьте одну каплю Монтаж среднего до каждого слайда </li><li> Добавить покровное. Избегайте воздушных пузырьков. </li><li> Изучить скользить по флуоресцентного микроскопа в течение 2 часов. </li><li> Не подвергайте слайды прямых солнечных лучей или других сильных источников света, так как это может привести к тушению флуоресценции. </li></ol> 9. Интерпретация результатов Флуоресцентный микроскоп используется для слайд экспертизы должны быть оборудованы AdvanDx Двойной Фильтр полосы и 60x или 100x нефти цели. QC слайды должны быть рассмотрены первые подтвердить, что гибридизация имели место. E. фекальный должен выглядеть ярко-зеленого флуоресцентного кокки в нескольких полях зрения и faecium Э. появится как ярко-красный кокки. Номера для энтерококков управления слайд должен появиться nonfluorescent. После подтверждения система контроля, пациент слайды могут быть рассмотрены. Сначала кровь филм появится красноватый, но яркий красный и зеленый кокки будет вполне очевидной. <img src="/files/ftp_upload/2616/2616fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Типичными примерами зеленый-положительных Е. фекальный (слева), красный положительный E. faecium (в центре) и отрицательных (справа) результаты испытаний. 10. Представитель Результаты Три учреждения были включены в многоцентровое клиническое исследование оценки этой рыбы ПНА пятна и сравнивая 2,5 часа протокола к укороченной 1,5 часа протокол, который только что был рецензирован. В общей сложности 152 рутинных грамположительных кокков в парах и цепи (ГПХ) положительные бутылки культуры крови были включены в исследования. Существовал 100% (152/152) соглашение между результатами модифицированы и оригинальная методика анализа для E. фекальный / OE ПНА FISH: 41/41 E. фекальный; 33/33 других энтерококков и других GPC 78/78 (табл. 1). Этот метод окрашивания был изысканной чувствительностью и специфичностью в течение этого клинического исследования (табл. 2). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Рутинные методы </td><td> Э. фекальный / OE ПНА FISH Стандартная процедура </td><td> Э. фекальный / OE ПНА FISH Короткая процедура </td></tr><tr><td> Э. фекальный </td><td> 41 </td><td> 41 (Зеленый Положительные) </td><td> 41 (Зеленый Положительные) </td></tr><tr><td> E. faecium </td><td> 27 </td><td> 27 (Красный Положительные) </td><td> 27 (Красный Положительные) </td></tr><tr><td> Е. casseliflavus </td><td> 2 </td><td> 2 (Красный Положительные) </td><td> 2 (Красный Положительные) </td></tr><tr><td> Е. gallinarum </td><td> 2 </td><td> 2 (Красный Положительные) </td><td> 2 (Красный Положительные) </td></tr><tr><td> Другие Enterococcus sрр. </td><td> 2 </td><td> 2 (Красный Положительные) </td><td> 2 (Красный Положительные) </td></tr><tr><td> С. пневмонии </td><td> 17 </td><td> 17 (Negative) </td><td> 17 (Negative) </td></tr><tr><td> С. viridans </td><td> 33 </td><td> 33 (Negative) </td><td> 33 (Negative) </td></tr><tr><td> С. Mitis </td><td> 1 </td><td> 1 (Negative) </td><td> 1 (Negative) </td></tr><tr><td> S. pyogenes </td><td> 3 </td><td> 3 (Negative) </td><td> 3 (Negative) </td></tr><tr><td> С. Bovis </td><td> 2 </td><td> 2 (Negative) </td><td> 2 (Negative) </td></tr><tr><td> С. salivarius </td><td> 1 </td><td> 1 (Negative) </td><td> 1 (Negative) </td></tr><tr><td> С. sanguinis </td><td> 2 </td><td> 2 (Negative) </td><td> 2 (Negative) </td></tr><tr><td> С. agalagtae </td><td> 7 </td><td> 7 (Negative) </td><td> 7 (Negative) </td></tr><tr><td> Другие стрептококки. </td><td> 7 </td><td> 7 (Negative) </td><td> 7 (Negative) </td></tr><tr><td> Abiotrophia sрр. </td><td> 3 </td><td> 3 (Negative) </td><td> 3 (Negative) </td></tr><tr><td> Peptostrepococcus sрр. </td><td> 2 </td><td> 2 (Negative) </td><td> 2 (Negative) </td></tr><tr><td> Общий </td><td> 152 </td><td> 152/152 100% Соглашения </td><td> 152/152 100% Соглашения </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Листинг бактерий испытания с использованием как стандартных (2.5hr) и быстрый (1,5 часа) протоколу. <table border="1"><tbody><tr><td> Чувствительность E.faecalis </td><td> Чувствительность Другие Enterococcus sрр. </td><td> Специфичность </td></tr><tr><td> 100% (41/41) 95% доверительный интервал (93.0-100) </td><td> 100% (33/33) 33/33 95% доверительный интервал (91.3-100) </td><td> 100% (78/78) 95% доверительный интервал (96.2-100) </td></tr></tbody></table> Таблица 2. Чувствительность и специфичность 1,5 часа протокол FISH ПНА.

<ol>
	<li>Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+and+differentiation+of+Enterococcus+faecalis+and+other+Enterococcus+species+directly+from+positive+blood+cultures+by+dual+color+fluorescence+in+situ+hybridization+using+PNA+probes.">Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes.</a> , (2002).</li><li>Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+E.+faecalis+PNA+FISH+for+rapid+identification+and+differentiation+of+Enterococcus+faecalis+and+other+Enterococcus+species+directly+from+positive+blood+cultures.">Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures.</a> , (2003).</li><li>Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+identification+of+Staphylococcus+aureus,+Enterococcus+faecalis,+and+Candida+albicans+from+blood+cultures+using+fluorescence+in+situ+hybridization+with+nucleic+acid+probes.">Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes.</a> , (2005).</li><li>Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+S.+aureus+PNA+FISH,+E.+faecalis+PNA+FISH+&#38;+C.+albicans+PNA+FISH+for+Rapid+Identification+of+Positive+Blood+Culture+Bottles.">Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH &#38; C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles.</a> , (2006).</li><li>Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Identification+of+Enterococcus+Species+in+Positive+Blood+Cultures+with+Therapeutic+Implications.">Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications.</a> , (2006).</li></ol>

Производство видео-статья была организована AdvanDx. Бенджамин Кристалл сотрудник AdvanDx, кто делает инструменты и реактивы, используемые в этой статье.

E. фекальный / OE ПНА FISH анализ для энтерококков может обеспечить идентификацию 2-3 дней раньше, чем стандартные методы культуры. Укороченной процедуре анализа (1,5 hourr) обеспечивает быструю идентификацию, которая может быть использована для лучшего подхода к антибактериальной терапии и пациента результат. Одно из исследований в поддержку этого была выполнена Форрест, и др.. (6). В течение двух лет подряд, начиная с 2005 года микробиологической лаборатории определили грамположительных кокков в пары и цепи, растущих в бутылках посев крови обычными микробиологическими методами и в 2006 году, добавив Е. фекальный / OE ПНА FISH. Кроме лечения алгоритма, разработанного специалистами учреждений антимикробных команды (AMT), чтобы эффективно использовать FISH ПНА данные, полученные в лаборатории в своевременной манере. Первичная оценка результата было время от посева крови привлечь к реализации эффективной антибактериальной терапии до и после ПНА FISH была учреждена в рабочий процесс лабораторий. Тяжесть болезни пациента местоположение и эмпирической антибактериальной терапии были измерены. Общей сложности 224 пациентов с больницы приобрели энтерококков бактериемии были оценены с 129 в до вмешательства период и 95 в период FISH ПНА. ПНА FISH определены E. фекальный 3 дня раньше, чем обычных культур (1,1 против 4,1 дней, р &lt;0,001). ПНА FISH определены E. faecium среднем 2,3 дня раньше (1,1 против 3,4 дней, р &lt;0,001) и был связан со статистически существенное сокращение времени начала эффективной терапии (1,3 против 3,1 дней, р &lt;0,001) и сократились на 30 день смертности (26% против 45%, р = 0,04). Это группа пришла к выводу, что E. фекальный / OE ПНА FISH анализа в сочетании с AMT алгоритм лечения привели к более ранним началом соответствующей эмпирической антибактериальной терапии у пациентов с больницы приобрели E. faecium бактериемии. <ol><li> Реагенты не следует использовать после даты истечения срока действия напечатаны на этикетках и реагенты не должны быть изменены в любом случае. Они должны находиться в холодильнике, когда не используется, или они могут потерять потенцию. </li><li> Кровь бутылки культуры нуждаются в смешанных до отбора проб. </li><li> Важно, чтобы не допустить наконечник флакона на ощупь мазке крови, потому что это может стать причиной перекрестного загрязнения материала между слайдами, или вызвать загрязнение реагента. </li><li> Убедитесь, что водяной бане и отопления блока поддерживается при постоянной температуре 55 ° C. </li><li> Не используйте фильтры, кроме двойного Фильтр полосы или цвета не будут четко различить. </li><li> Не используйте предметные стекла, кроме микроскопа слайды или гибридизации не произойдет. </li><li> Очень важно, чтобы микроскоп работает нормально. Убедитесь, что лампа микроскопа в рамках утвержденного количества часов для использования. </li></ol><ul><li> Некоторые редкие встречающиеся виды Enterococcus не обнаруживаются зонда ПНА гибридизации с другими видами Enterococcus, таких как E. asinii, E.dispar, Е. haemoperoxidus, Е. cecorum, Е. columbae, Е. saccharolyticus, Е. solitarius и Е . сернистого. </li><li> Е. moraviensis определяется как E. фекальный из-за последовательности сходство. </li><li> Некоторые штаммы Streptococcus anginosus производить ложные положительные зеленый флуоресценции из-за последовательности сходство. </li><li> VersaTREK бутылки посев крови не были оценены во время клинических исследований. Производительность для обнаружения E. фекальный и других Enterococcus sрр. с бутылками VersaTREK посева крови неизвестны. </li><li> Ложное срабатывание зеленый аутофлюоресценция может произойти, если стандартные FITC фильтр используется вместо двойного фильтра Band. </li><li> Ложные отрицательные результаты могут часто возникать из-за смешанных роста или из-за ошибки в анализе техники. </li><li> Типа и состояния приборы, используемые будет влиять на внешний вид изображения получены. Флуоресценции может varydue на тип микроскопа работу, источник света и уровень РНК в клетках </li><li> Изоляция на твердых средах необходимо дифференцировать смешанные роста с другими организмами и выявления положительных культур крови приносит отрицательный результат. </li><li> Продукт не был подтвержден в образцах крови, чем другие культуры. </li></ul>

Реагенты Э. фекальный / OE ПНА FISH состоит из следующих компонентов комплекта: <ul><li> Фиксация Фиксация Решение Решение 3 мл фосфатно-солевом буфере с моющим средством. </li><li> Э. фекальный / О. Е. Е. ПНА фекальный / OE ПНА 1,5 мл ПНА зондов при гибридизации. решение. Содержит 30% формамида. </li><li> 60x 60x промывочного раствора промывочного раствора 50 мл Трис-буферном растворе с моющим средством </li><li> Монтаж Монтаж Средний Средний 3 мл фотообесцвечивания ингибитора в Глицерин </li><li> Слайды Контроль качества </li><li> <a href="http://www.advandx.com">AdvanDX</a> </li></ul>

a 1.5 hour procedure for identification of enterococcus species directly from blood cultures

Энтерококки являются частой причиной бактериемии с Е. фекальный быть доминирующих видов следуют E. faecium. Потому что устойчивость к ампициллину и ванкомицину в E. фекальный еще необычного по сравнению с сопротивлением в E. faecium, развитие экспресс-тестов позволяет дифференциации между видами энтерококков имеет важное значение для соответствующей терапии и сопротивления наблюдения. E. фекальный OE ПНА FISH анализа (AdvanDx, Woburn, MA) использует видоспецифические пептидных нуклеиновых кислот (ПНК) зондов в флуоресценции на месте формате гибридизации и предлагает время результаты 1,5 часа и потенциальных предоставления важной информации для видоспецифические лечение. Многоцентровое исследования проводились для оценки производительности 1,5 часа E. фекальный / OE ПНА FISH процедуры по сравнению с оригинальной 2,5 часа процедура анализа и стандартные методы бактериологии для идентификации энтерококков прямо из бутылки положительные культуры крови.

Watch this Scientific Journal Video about A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures at JoVE.com

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Быстрый протокол для непосредственной идентификации Enterococcus фекальный и другие виды Enterococcus с положительной культуры крови с использованием пептидов нуклеиновых кислот флуоресцентного анализа на месте гибридизация (FISH ПНА).

1,5 час порядок идентификации Enterococcus Виды Непосредственно из культуры крови

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Однодневный рабочий процесс Схема бактериальных патогенов обнаружения и антимикробной сопротивления из крови культур

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Генерация органотипической культур Плот из первичных кератиноцитов человека

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Выделение предшественника В-клеточных подмножеств из пуповинной крови

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Всего экстракции белка и 2-D электрофореза в геле Методы<em&gt; Burkholderia</em&gt; Вид

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Процедуры выявления инфекционных прионов после прохождения через пищеварительный тракт птичьего видов

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Подготовка крови культуры Пелле для быстрого идентификации бактерий и чувствительности к антибиотикам

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Использование моноцитов монослоя анализе для оценки Fcγ рецептор-опосредованного Фагоцитоз

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...