Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

معتمد من قبل EJV الزمالة من مؤسسة ستاندرد اند كرون التهاب القولون الأمريكية (CCFA). ويدعم JRM من المنح المقدمة من CCFA ، معهد بحوث السرطان (كوستاريكا) ، هوارد H. غودمان (MGH) ، ماساشوستس مركز علوم الحياة (MLSC) وجائزة مدير معاهد الصحة القومية ليالي مبتكر جديد.

1. فيفو الجيل السابق من الخلايا T - هومينغ الأمعاء والسيطرة (انظر الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل splenocytes بواسطة يهرس one الطحال نوع من الفئران البرية. Resuspend تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 &quot;في غرام × 400 ...

<ol>
	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

على الرغم من التجارب صاروخ موجه تقديم معلومات قيمة للغاية حول هجرة السكان الكلي في أي خلية نسيج معين ، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن هذه المقايسات لا نحلل مباشرة الالتصاق البطانية وبالتالي فهي لا تميز فيها الخطوة (ق) من الالتصاق متعددة الخطوات شلال (الربط / المتداول ، أ...

الحيوانات : تستخدم عادة C57BL / 6 الفئران لعزل الخلايا التائية. بالإضافة إلى ذلك ، وCD45.1 Thy1.1 سلالات مسانج متاحة من خلال مختبرات جاكسون (بار هاربور ، ME). الثقافة وسائل الإعلام : IMDM (متوسطة Iscove في التعديل Dulbecco ل+ L - الجلوتامين + Hepes) ، بالإضافة إلى 10 ٪ للحرارة المعطل FBS (الأبقار مصل الجنين ، الذيفان الداخلي منخفضة ، Gibco ® ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) استكملت مع 100 U / البنسلين مل ، 100 ملغ / مل الستربتوميسين (المضادات الحيوية HyClone ، التايم ، ماجستير) ، و 0.5 ملغ / مل fungizone / الأمفوتريسين B (Gibco) ، و 50 ملي ب - المركابتويثانول. ACK خلايا الدم الحمراء العازلة تحلل (RBC ، 10 ملي KHCO 3 ، 150 مم NH 4 CL ، EDTA 0.1 ملم ، ودرجة الحموضة 8.0) ، وضبط درجة الحموضة إلى 7،2-7،4 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة). PBS (الفوسفات التخزين المؤقت المالحة ، Hyclone ، التايم ، ماجستير). التدفق الخلوي (FACS) وسائل الاعلام (PBS أو IMDM + 2 + 5 ٪ FBS ملي EDTA). عندما تلطيخ باستخدام Selectin - FC الوهم وسائل الاعلام مع CA مم 2 + + ينبغي استخدامها في جميع الخطوات (بما في ذلك حيازة FACS). ينصح IMDM في هذه القضية. تي وسم الخلية ونقل بالتبني : CFSE (carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات ، succinimidyl استر) ، CMTMR ((5 -- (و- 6 - 4)-((( كلوروميثيل) بيروكسايد) الأمينية) tetramethylrhodamine) من المسابر الجزيئية ® ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ). وينبغي بذل 1000 x في مخزونات DMSO (5 CFSE ملم ، 20 ملم CMTMR) وتخزينها في -20 درجة مئوية. النسائل المتعددة تنشيط الخلايا T : 24 أو 96 بشكل جيد جيدا لوحات (الأنسجة ثقافة المعالجة ، والبوليسترين ، مسطحة القاع مع غطاء ، BD فالكون ، فرانكلين البحيرات ، ونيو جيرسي) هي المحتضنة لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية مع 50 مل من برنامج تلفزيوني ، على التوالي تتضمن مكافحة CD3 زائد المضادة للأضداد CD28 (10 ملغ / مل لكل منهما). ثم ، يتم غسلها لوحات ثقافة مرتين مع برنامج تلفزيوني واستخدامها على الفور للثقافة الخلايا التائية. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Dynabeads المغلفة مع anti-CD3/anti-CD28 (Dynal ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) لتنشيط خلايا تي بدلا من لوحة متجهة الأضداد. التدفق الخلوي (FACS) تلطيخ : تفعيل النسائل المتعددة : CD3 (1452C11) ، CD28 (37.51). نسب MAB : CD4 (L3T4) ، CD8a (لي - 2) ، Thy1.2 (CD90.2/53-1.2) ، CD45.2 (104). القناة الهضمية ، صاروخ موجه المستقبلات : تنقية CCR9 (CD199/eBioCW-1.2 ، eBioscience ، سان دييغو ، كاليفورنيا) ، a4b7 (LPAM-1/DATK3) ، والسيطرة isotype (IgG2a ، ك). صاروخ موجه مستقبلات الجلد : P - selectin - FC (منقى ماوس ف Selectin -- مفتش البروتين الانصهار ، Pharmingen دينار بحريني ، سان خوسيه ، كاليفورنيا) ، E - selectin FC - (المؤتلف E-Selectin/Fc ماوس الوهم ، R &amp; D أنظمة ، مينيابوليس ، MN) ، بالإضافة إلى المقابلة الماعز كاشف F الثانوية (أ ب &#39;) 2 المضادة للمفتش الإنسان R - PE (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا). هو معلق جميع العابر حمض الريتينويك (سيغما ، وسانت لويس ، MO) في الإيثانول المطلق أو DMSO باستخدام لمبة صفراء أو مصدر غير مباشر للضوء أثناء التحضير. aliquots تخزينها في قارورة زجاجية في -80 درجة مئوية ، ومحمية من الضوء في جميع الأوقات. RAR الاصطناعية ناهضات : Am80 (اكو كيماويات ، ريتشموند ، فيرجينيا).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

من أجل ممارسة وظيفتها اللمفاويات الحاجة إلى مغادرة الدم وتهاجر إلى الأنسجة المختلفة في الجسم. التصاق الخلايا اللمفاوية لخلايا بطانة الأوعية الدموية والأنسجة التسرب هو عملية متعددة الخطوات التي تسيطر عليها التصاق جزيئات مختلفة (صاروخ موجه المستقبلات) في الخلايا الليمفاوية وأعرب كل منهما يغاندس (addressins) المعروضة على الخلايا البطانية 1 2. على الرغم من يمكن أن تكون وظيفة هذه المستقبلات التصاق درس جزئيا خارج الحي ، والاختبار النهائي لأهميتها الفسيولوجية هو تقييم دورها في خلال التصاق الخلايا اللمفاوية فيفو والهجرة. وقد استخدمت استراتيجيتين تكميلية لهذا الغرض : intravital المجهري (IVM) ، وتجارب صاروخ موجه. على الرغم من IVM كانت ضرورية لتحديد دقيق للمساهمة مستقبلات الالتصاق محددة خلال تتالي التصاق في الوقت الحقيقي والأنسجة المختلفة ، IVM تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة ، فإنه غالبا ما يتطلب تطوير تقنيات جراحية متطورة ، فإنها بحاجة إلى العزلة من قبل متجانسة السكان الخلية ويسمح تحليل واحد فقط الجهاز / الأنسجة في أي وقت من الأوقات. على النقيض من ذلك ، والتجارب صاروخ موجه تنافسية تسمح المقارنة المباشرة والفورية في الهجرة من اثنين (أو أكثر) مجموعات فرعية خلية في الماوس نفسه ، وأنها تسمح أيضا تحليل العديد من الأنسجة وعدد كبير من الخلايا في التجربة نفسها. نحن هنا وصف الكلاسيكية بروتوكول صاروخ موجه تنافسية استخدمت لتحديد ميزة / الحرمان من نوع الخلية بالنظر إلى المنزل لأنسجة معينة بالمقارنة مع التحكم في عدد السكان الخلية. اخترنا لتوضيح خصائص المهاجرة مدار - الأمعاء الأمعاء ، مقابل عدم مدار الخلايا التائية ، وذلك لأن الغشاء المخاطي المعوي هو السطح أكبر هيئة في اتصال مع البيئة الخارجية وأنه هو أيضا من خارج النسيج اللمفاوي أفضل مع متطلبات محددة المهاجرة . وعلاوة على ذلك ، فقد قرر العمل مؤخرا بأن فيتامين (أ) المستقلب جميع العابر حمض الريتينويك (RA) هي الآلية الرئيسية الجزيئية المسؤولة عن التصاق الأمعاء تحريض مستقبلات محددة (إنتغرين مستقبلات chemokine a4b7and CCR9) في الخلايا الليمفاوية. وبالتالي ، فإننا قادرون على توليد بسهولة أعداد كبيرة من فيفو السابقين الأمعاء ، وغير مدار الأمعاء ، عن طريق تنشيط الخلايا الليمفاوية مدار خلايا تي في وجود أو عدم وجود التهاب المفاصل الروماتويدي ، على التوالي ، والتي يمكن استخدامها أخيرا في التجارب صاروخ موجه التنافسية الموصوفة هنا.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

تجارب صاروخ موجه تنافسية تسمح لتقييم الخصائص الكثيرة مباشرة من اثنين من السكان مختلفة من الخلايا في ماوس واحدة. نحن هنا لتوضيح هذا الإجراء من خلال مقارنة الهجرة من خارج الحي ولدت مدار - الأمعاء مقابل عدم الأمعاء مدار الخلايا التائية.

الزاجل فحوصات تنافسية لدراسة غوت - مدار هجرة الخلايا التائية

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة والتحليل للهجرة في المختبر</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

غير الغازية تصوير الزاجل كريات بيضاء والهجرة في الجسم الحي</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

A التقييم الكمي للهجرة الخليوي من قبل مصلحة دمغ المصوغات المسار على الحركة Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

تنبيغ الفيروسة الغدانية من CD4 الخلايا التائية ساذج لدراسة التمايز Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

زرع الجلد الذيل لدراسة خيفي CD4 T الردود الخليوي في الفئران

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

التصوير CD4 T خلية الخلالية الهجرة في الأدمة الملتهبة

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

مقايسة على أساس CFSE لدراسة الهجرة من الجلد الفئران الخلايا الجذعية في تصريف الغدد الليمفاوية خلال العدوى مع<em&gt; المتفطرة البقرية</em&gt; عصيات كالميت غيران

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

باستخدام الأشعة السينية البلورات، الفيزياء الحيوية، وفحوصات وظيفية لتحديد آليات الحكم تي خلية مستقبلات الاعتراف السرطان المستضدات

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...