Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
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合资是由来自美国S＆结肠炎克罗恩基金会（CCFA）的奖学金支持。 JRM是支持由中国连锁经营协会，癌症研究所（CRI）的，霍华德H.古德曼（MGH），马萨诸塞州的生命科学中心（MLSC）和美国国立卫生研究院主任最新创新奖助学金。

1。 前肠道归巢和控制T细胞的体内产生（见图1 ） <ol><li>隔离糖化从野生型小鼠脾脾。在PBS的细胞悬液，离心重悬为5 400 × G.取出上清液和裂解红细胞resuspending在2-3分钟的ACK裂解液4毫升细胞沉淀。之后，添加5毫升的PBS。 5 400 XG离心去除上清。 </li><li>总脾重悬在1 × 10 6 /毫升的IMDM + 10％FBS + 50毫米2 -巯基乙醇+青霉素/链霉素（完整的IMDM）。分开两组，其中之一是与RA（或合成?...

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	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

即使归巢的实验提供了非常宝贵的有关在任何特定的组织细胞总人口的迁移的信息，应牢记这些实验不直接分析内皮细胞粘附，因此不歧视的多级粘连步骤（S）级联（圈养/滚动，激活或坚持）一个给定的归巢受体行事。黄金标准中定义的粘附级​​联的归巢受体的具体的作用，是活体显微镜（IVM），其中个人荧光标记的T细胞（或其他细胞，甚至荧光标记的珠）直接观察与内皮细胞的实时交互。?...

动物：C57BL / 6小鼠的T细胞隔离。此外，杰克逊实验室（ME）的巴尔港，CD45.1和Thy1.1 congenic株都可以通过。 文化传媒：IMDM（Iscove的修改贝科的中等+ L -谷氨酰胺+ HEPES），加上10％ 的热量，灭活胎牛血清 （胎牛血清，低内毒素，GIBCO ®，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚）辅以100 ü / ml青霉素，100毫克/ ml链霉素（Hyclone公司抗生素，马萨诸塞州沃尔瑟姆），0.5毫克/毫升fungizone /两性霉素B（GIBCO），B -巯基乙醇和50毫米。 ACK红血细胞裂解液 （红细胞，10毫米KHCO 3 0.1毫米，150毫米NH 4 CL，EDTA，pH值8.0），调整pH值7.2-7.4，并储存在室温下）。 PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，Hyclone公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆，）。 流式细胞仪（FACS）媒体 （PBS或IMDM + 2％FBS + 5 mM的EDTA）。当染色选择- FC的嵌合体，媒体使用2毫米钙+ +应该是所有步骤中使用（包括流式细胞仪收购） 。在这种情况下，建议IMDM培养。 T细胞的标签和过继转移：CFSE（羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯），CMTMR（（5 - （6 )-((( 4 -氯甲基）苯甲酰）氨基）四甲）自Molecular Probes ®，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA ）。 1000 ×股票应是在DMSO（CFSE 5毫米，20毫米CMTMR），并储存在-20 ° C 多克隆T细胞的活化 ：24孔或96孔板（组织培养处理，聚苯乙烯，平底，有盖的，位于美国新泽西州富兰克林湖，屋宇署猎鹰）孵育2小时，分别在37℃， 50毫升PBS含有抗CD3加抗CD28抗体（10毫克/毫升）。然后，培养板，用PBS洗两次，并立即用于T细胞培养。另外，anti-CD3/anti-CD28（DYNAL，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）涂层磁珠可用于对T细胞的活化，而不是板结合的抗体。 流式细胞仪（FACS）染色：多克隆活化：CD3（1452C11），CD28（37.51）。天堂单克隆抗体：CD4（L3T4），CD8a（LY - 2），Thy1.2（CD90.2/53-1.2），CD45.2（104）。肠道归巢受体：纯化CCR9（CD199/eBioCW-1.2，eBioscience公司，圣迭戈，CA），a4b7（LPAM-1/DATK3），同型对照 （IgG2a，K）。皮肤归巢受体：P -选择素- FC（纯化的小鼠P -选择- IgG融合蛋白，BD Pharmingen公司，圣何塞，加利福尼亚州），E -选择素- FC（重组小鼠E-Selectin/Fc奇美拉，R＆D系统，明尼阿波利斯， MN），加上相应的辅助试剂山羊F（AB）2抗人IgG的R - PE（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）。 全反式维甲酸 （Sigma公司，圣路易斯，密苏里州）是悬浮于无水乙醇或使用一个黄色的灯泡或间接的光线来源，在筹建期间DMSO的。商店的玻璃小瓶分装于-80 ° C和避光在任何时候。合成的RAR -受体激动剂：Am80（和光化工，里士满，弗吉尼亚州）。

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

为了发挥其功能的淋巴细胞，需要离开血液和迁移到身体的不同组织。淋巴细胞粘附于血管内皮细胞和组织外渗是一个多步骤的过程，不同的粘附分子控制（归巢受体）对淋巴细胞和各自的配体（addressins）1 2内皮细胞上显示。即使这些粘附受体的功能，可部分研究体外，其生理意义的最终测试，以评估他们的作用 ，在体内淋巴细胞的黏附和迁移。两个相辅相成的策略已经用于此目的：活体显微镜（IVM）和归巢的实验。虽然IVM必须确定精确的实时性和在不同组织中的粘附级联在特定的粘附受体的贡献，IVM的是耗费时间和劳动力密集，往往需要复杂的外科技术的发展，它需要同质化的前隔离细胞群，它允许在任何给定的时间只有一个组织/器官的分析。与此相反，有竞争力的归巢实验允许的直接同步比较，在相同的鼠标在两个移民（甚至更多）的细胞亚群，他们还允许许多组织和分析大量的细胞在相同的实验。 在这里，我们描述古典的竞争归巢的协议，用于特定组织，以确定一个给定的细胞类型的优势/缺点相比，控制细胞群。我们选择来说明肠道热带与非肠道嗜T细胞的迁徙，因为肠道黏膜是与外部环境最大的身体接触表面，它也是与最好的定义的迁徙要求额外的淋巴组织。此外，最近的工作已经确定，维生素代谢产物的全反式维甲酸（RA）诱导淋巴细胞的肠道特异性粘附受体（整合a4b7and趋化因子受体CCR9）负责的主要分子机制。因此，我们可以很容易地通过激活T细胞在RA的存在或缺乏肠道热带和非肠道嗜淋巴细胞体外大量产生，分别，终于可以在这里所描述的竞争归巢实验。

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

竞争归巢实验允许直接评估一个鼠标的两个不同的细胞群的洄游特性。在这里，我们说明了此过程中，通过对比前体内产生的肠道热带与非肠嗜T细胞迁移。

竞争的原点实验研究肠嗜T细胞迁移

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

迁移人T淋巴细胞分离，培养和分析<em在体外</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

科研

免疫与感染

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

白细胞的归位和迁移的非侵入性的成像在体内</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T细胞受体在小鼠T细胞的逆转录病毒转导

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

细胞迁移的的Phagokinetic轨道运动MLCK的定量评价

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

腺病毒转导朴素的CD4 T细胞调节性T细胞分化研究

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

尾部皮肤来研究异基因CD4 + T细胞应答的小鼠移植

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

鼠标朴素CD4<sup&gt; +</sup&gt; T细胞分离和<em&gt;在体外</em&gt;分化为T细胞亚群

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

成像的CD4 T细胞间质迁移发炎真皮

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

基于CFSE-试验鼠皮肤树突状细胞的迁移习进引流淋巴结在与感染<em&gt;牛分枝杆菌</em&gt;卡介苗

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

利用X射线晶体学，生物物理学，和功能分析，以确定管理机制T细胞癌抗原的受体识别

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...