Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

EJV wordt ondersteund door een beurs van de Crohn en Colitis Ulcerosa s Foundation of America (CCFA). JRM wordt ondersteund door subsidies van CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) en New Innovator NIH directeur s Award.

1. Ex vivo generatie van darm-homing en controle op T-cellen (zie figuur 1) <ol><li> Isoleer splenocyten door stampen een milt van wild-type muizen. Resuspendeer de cellen suspensie in PBS en centrifugeer gedurende 5 &#39;op 400 x g. Verwijder het supernatant en lyseren van de rode bloedcellen door resuspenderen de cel pellet in 4 ml van ACK lysis buffer voor 2-3 minuten. Daarna, voeg 5 ml PBS. Centrifugeer gedurende 5 &#39;op 400 xg en verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer totaal splenocyten op 1...

<ol>
	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

Hoewel homing experimenten zorgen voor een zeer waardevolle informatie over de migratie van het totaal celpopulaties in een bepaald weefsel, moet in gedachten worden gehouden dat deze testen niet rechtstreeks endotheel hechting daarom te analyseren en niet discrimineren, waarin stap (pen) van de meerstaps hechting cascade (tethering / rollen, activering of plakken) een bepaalde homing receptor optreedt. De gouden standaard om de specifieke rol van de homing-receptoren te definiëren in de hechting cascade is intravitale...

Dieren: C57BL / 6 muizen worden vaak gebruikt voor het T-cel isolatie. Daarnaast, CD45.1 en Thy1.1 congenic stammen zijn beschikbaar via Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Cultuur media: IMDM (Iscove&#39;s gemodificeerd Dulbecco&#39;s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% hitte-geïnactiveerd FBS (Fetal Bovine Serum, een lage endotoxine, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA), aangevuld met 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine (Hyclone Antibiotica, Waltham, MA), 0,5 mg / ml fungizone / amfotericine B (Gibco), en 50 mM b-mercapto-ethanol. ACK Red Blood Cell Lysis buffer (RBC, 10 mM KHCO 3, 150 mM NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), aan te passen aan de pH 7,2-7,4 en op te slaan op kamertemperatuur). PBS (fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing, Hyclone, Waltham, MA). Flowcytometrie (FACS) media (PBS of IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). Wanneer kleuring met behulp van selectine-Fc hersenschimmen, media met 2 mM Ca + + moet worden gebruikt in alle stappen (inclusief FACS acquisitie). IMDM is aan te bevelen in dit geval. T-cel etikettering en de adoptieve overdracht: CFSE (carboxyfluoresceïne diacetaat, succinimidylester), CMTMR ((5 - (en-6 )-((( 4-chloormethyl) benzoyl) amino) tetramethylrodamine) van Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, Californië ). 1000 x voorraden moeten worden gemaakt in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) en opgeslagen bij -20 ° C. Polyklonale T-cel activatie: 24-well of 96-well platen (tissue-cultuur behandeld, polystyreen, vlakke bodem met deksel, BD Falcon, Franklin Lakes, New Jersey) zijn gedurende 2 uur bij 37 ° C met 50 ml PBS, met respectievelijk , met anti-CD3 plus anti-CD28 antilichamen (10 mg / ml per stuk). Vervolgens worden kweekplaten tweemaal gewassen met PBS en direct gebruikt voor de T-cel cultuur. Als alternatief kan Dynabeads gecoat met anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) worden gebruikt voor de T-cel activatie in plaats van plaat-gebonden antilichamen. Flowcytometrie (FACS) kleuring: Polyklonale activering: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptoren: gezuiverd CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotype controle (IgG2a, k). Skin-homing receptoren: P-selectine-Fc (Gezuiverd Mouse P-selectine - IgG-fusie-eiwit, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectine-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) plus bijbehorende secundaire reagens geit F (ab &#39;) 2 anti-humaan IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). All-trans-retinoïnezuur (Sigma, St. Louis, MO) is geresuspendeerd in absolute ethanol of DMSO met behulp van een gele lamp of een onrechtstreeks, een bron van licht tijdens de voorbereiding. Bewaar aliquots in glazen flesjes bij -80 ° C en beschermd tegen licht te allen tijde. Synthetische RAR-agonisten: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

Om te oefenen hun functie lymfocyten moet het bloed te verlaten en in verschillende weefsels in het lichaam migreren. Lymfocyten hechting op endotheliale cellen en weefsels extravasatie is een complex proces gecontroleerd door verschillende adhesiemoleculen (homing-receptoren) uitgedrukt op lymfocyten en hun respectieve liganden (addressins) getoond op endotheelcellen 1 2. Ook al is de functie van deze receptoren hechting kan gedeeltelijk worden bestudeerd ex vivo, de ultieme test voor hun fysiologische relevantie is om hun rol te evalueren tijdens de in-vivo-lymfocyten adhesie en migratie. Twee complementaire strategieën zijn gebruikt voor dit doel: intravitale microscopie (IVM) en homing experimenten. Hoewel de IVM is essentieel om de precieze bijdrage van specifieke adhesie receptoren tijdens de hechting cascade in real time en in verschillende weefsels te definiëren, IVM is tijdrovend en arbeidsintensief, vaak de ontwikkeling van geavanceerde chirurgische technieken vereist, moet het voorafgaande scheiding van homogene celpopulaties en het mogelijk maakt de analyse van slechts een weefsel / orgaan op een bepaald moment. Daarentegen, concurrerende homing experimenten laat de directe en gelijktijdige vergelijking in de migratie van twee (of zelfs meer) cel subsets in dezelfde muis en ze ook toestaan ​​dat de analyse van een groot aantal weefsels en van een groot aantal cellen in hetzelfde experiment. Hier beschrijven we de klassieke concurrerende homing protocol dat wordt gebruikt in het voordeel / nadeel van een bepaald celtype te bepalen naar huis om specifieke weefsels in vergelijking met een controle-celpopulatie. We hebben ervoor gekozen om de trekkende eigenschappen van darm-tropische versus niet gut-tropische T-cellen te illustreren, omdat het darmslijmvlies is de grootste lichaamsoppervlak in contact met de externe omgeving en het is ook de extra-lymfoïde weefsel met de beste gedefinieerde trekkende eisen . Bovendien heeft recent werk vastgesteld dat de vitamine A metaboliet all-trans retinoïnezuur (RA) is de belangrijkste moleculaire mechanisme dat verantwoordelijk is voor het induceren van darm-specifieke aanhechting receptoren (integrine a4b7and chemokine-receptor CCR9) op lymfocyten. Zo kunnen we snel grote aantallen van darm-tropische als niet-tropische darm lymfocyten ex vivo door het activeren van T-cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van RA, respectievelijk, die uiteindelijk kan worden gebruikt in de concurrerende homing experimenten hier beschreven.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Concurrerende homing experimenten toelaten om rechtstreeks de beoordeling van de trekkende eigenschappen van twee verschillende celpopulaties in een muis. Hier hebben we illustreren deze procedure door het vergelijken van de migratie van ex vivo gegenereerde gut-tropische versus niet-gut tropische T-cellen.

Concurrerende Homing Testen om de Gut-tropische T-cel-migratie Study

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T-lymfocyt Isolatie, Cultuur en Analyse van de migratie In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Niet-invasieve beeldvorming van Leukocyte Homing en migratie In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Een kwantitatieve evaluatie van celmigratie door de Phagokinetic Track Motiliteit Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantatie van Tail Skin aan allogene CD4 T-cel responsen bij muizen

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

A-CFSE gebaseerde test om de migratie van de huid van muizen dendritische cellen Onderzoek naar drainerende lymfeklieren tijdens infectie met<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Via röntgenkristallografie, Biophysics en functionele testen om de mechanismen van T-cel-receptorherkenning van kankerantigenen bepalen

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...