Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

CPA est soutenu par une bourse de la maladie de Crohn S &amp; Colitis Foundation of America (CCFA). JRM est soutenu par des subventions de CCFA, le Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (HGM), dans le Massachusetts Life Science Center (MLSC) et le Prix du directeur des NIH s Innovateur Nouvelle.

1. Génération ex vivo de cellules T gut-homing et de contrôle (voir Figure 1) <ol><li> Isoler splénocytes en écrasant une rate de souris de type sauvage. Resuspendre la suspension des cellules dans du PBS et centrifuger pendant 5 &#39;à 400 x g. Enlever le surnageant et lyser les globules rouges par la remise en suspension du culot cellulaire dans 4 ml de tampon de lyse ACK pendant 2-3 minutes. Après cela, ajoutez 5 ml de PBS. Centrifuger pendant 5 &#39;à 400 xg et retirer le surnageant. </li><li> Res...

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	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

Même si des expériences homing fournir des informations très précieuses sur la migration des populations de cellules au total dans tout tissu donné, il faut garder à l&#39;esprit que ces essais ne concernent pas directement l&#39;analyse d&#39;adhérence endothéliales et donc ne soient pas discriminatoires dans lequel l&#39;étape (s) de l&#39;adhésion à plusieurs étapes cascade (tethering / roulement, l&#39;activation ou de coller) un récepteur donné homing agit. L&#39;étalon-or pour définir le rôle spé...

Animaux: souris C57BL / 6 sont couramment utilisés pour l&#39;isolement de lymphocytes T. En outre, CD45.1 et Thy1.1 souches congéniques sont disponibles par le biais de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Milieux de culture: IMDM (milieu Iscove Dulbecco modifié par + L-glutamine + HEPES) majoré de 10% de la chaleur de FBS inactivé (sérum de veau fœtal, l&#39;endotoxine bas, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA), supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine (antibiotiques HyClone, Waltham, MA), 0,5 mg / ml fungizone / amphotéricine B (Gibco), et 50 mM b-mercaptoéthanol. ACK tampon lyse des globules rouges (RBC, 10 mM de KHCO3, 150 mM de NH 4 Cl, EDTA 0,1 mM, pH 8,0), ajuster le pH à 7.2 à 7.4 et stocker à température ambiante). PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA). La cytométrie en flux (FACS) médias (PBS ou IMDM + 2% de FBS + EDTA 5 mM). Lorsque coloration utilisant la sélectine-Fc chimères, des médias avec 2 mM de Ca + + doit être utilisé dans toutes les étapes (y compris l&#39;acquisition FACS). IMDM est recommandé dans ce cas. Marquage des cellules T et le transfert adoptif: CFSE (diacétate de carboxyfluorescéine, succinimidyl ester), CMTMR ((5 - (et-6 )-((( 4-chlorométhyl) benzoyl) amino) tétraméthylrhodamine) de Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1000 x stocks doit être faite dans le DMSO (5 CFSE mm, 20 mm CMTMR) et conservés à -20 ° C. Polyclonaux activation des cellules T: 24-puits ou plaques de 96 puits (de culture de tissus traités, polystyrène, fond plat avec couvercle, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) sont incubées pendant 2 heures à 37 ° C avec 50 ml de PBS, respectivement , contenant des anti-CD3 et anti-CD28 (10 mg / ml chacun). Ensuite, des plaques de culture sont lavées deux fois avec du PBS et utilisées immédiatement pour la culture cellulaire T. Alternativement, Dynabeads recouvert d&#39;anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) peut être utilisé pour l&#39;activation des cellules T au lieu de la plaque liée anticorps. La cytométrie en flux (FACS) coloration: activation polyclonale: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage MAB: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing récepteurs: CCR9 purifiée (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, Californie), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotype contrôle (IgG2a, k). Peau-homing récepteurs: la P-sélectine-Fc (purifiée souris P-sélectine - protéine de fusion IgG, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-sélectine-Fc (E-Selectin/Fc recombinant de souris chimère, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) et correspondante F secondaires de chèvre réactif (ab &#39;) 2 anti-IgG humaine R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). Acide tout-trans rétinoïque (Sigma, St. Louis, MO) est remis en suspension dans l&#39;éthanol absolu ou le DMSO en utilisant une ampoule jaune ou une source indirecte de la lumière lors de la préparation. Aliquotes Conserver dans des flacons en verre à -80 ° C et protégé de la lumière à tout moment. RAR-agonistes synthétiques: AM80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

Afin d&#39;exercer leur fonction de lymphocytes besoin de quitter le sang et migrent dans les différents tissus de l&#39;organisme. L&#39;adhérence des lymphocytes aux cellules endothéliales et l&#39;extravasation des tissus est un processus en plusieurs étapes contrôlées par des molécules d&#39;adhérence différentes (récepteurs homing) exprimée sur les lymphocytes et leurs ligands respectifs (adressines) affiché sur les cellules endothéliales 1 2. Même si la fonction de ces récepteurs d&#39;adhésion peut être partiellement étudiée ex vivo, le test ultime pour leur pertinence physiologique est d&#39;évaluer leur rôle au cours de l&#39;adhérence des lymphocytes in vivo et la migration. Deux stratégies complémentaires ont été utilisés à cette fin: la microscopie intravitale (IVM) et des expériences homing. Bien IVM a été essentielle pour définir la contribution précise de récepteurs d&#39;adhésion spécifiques lors de la cascade d&#39;adhérence en temps réel et dans différents tissus, l&#39;IVM prend du temps et de main-d&#39;oeuvre, il faut souvent le développement de techniques sophistiquées de chirurgie, il a besoin d&#39;isolement avant d&#39;homogénéité populations de cellules et il permet l&#39;analyse d&#39;un seul tissu / organe à un moment donné. En revanche, la compétitivité des expériences homing permettre la comparaison directe et simultanée dans la migration de deux (ou même plus) sous-ensembles de cellules dans la même souris et ils permettent également l&#39;analyse de nombreux tissus et d&#39;un nombre élevé de cellules dans la même expérience. Nous décrivons ici les classiques du protocole concurrentiel homing utilisé pour déterminer l&#39;avantage / désavantage d&#39;un type cellulaire donné à la maison à des tissus spécifiques par rapport à une population de cellules de contrôle. Nous avons choisi d&#39;illustrer les propriétés migratoires des intestins à tropisme intestinal par rapport aux non-tropique des cellules T, parce que la muqueuse intestinale est la plus grande surface du corps en contact avec l&#39;environnement extérieur et il est aussi le tissu extra-lymphoïdes avec les exigences mieux définies migrateurs . Par ailleurs, des travaux récents ont établi que le métabolite de la vitamine A acide tout-trans rétinoïque (RA) est le principal mécanisme moléculaire responsable de l&#39;induction récepteurs d&#39;adhésion intestinale spécifique (récepteur de chimiokine intégrine a4b7and CCR9) sur les lymphocytes. Ainsi, nous pouvons facilement générer un grand nombre d&#39;ex vivo tropisme intestinal et non gut-tropic lymphocytes T en activant les cellules en présence ou en absence de RA, respectivement, ce qui peut être finalement utilisés dans les expériences décrites ici concurrentiel homing.

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Concurrentiels expériences homing permettent d&#39;évaluer directement les propriétés migratoires des deux populations cellulaires différentes dans une seule souris. Ici, nous illustrons cette procédure en comparant la migration des ex vivo généré gut-tropic versus non-intestinale des cellules T tropiques.

Les analyses concurrentielles Homing d&#39;étude Gut tropisme migration des lymphocytes T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T isolement des lymphocytes, de la Culture et de l&#39;analyse des migrations In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Recherche

Immunologie et infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

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L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Une évaluation quantitative de la migration cellulaire par le test de motilité piste Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Transduction Adenoviral de CD4 naïfs cellules T pour étudier la différenciation Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation de queue peau d&#39;étudier allogéniques CD4 réponses des cellules T chez la souris

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

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Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Un test basé CFSE pour étudier la migration de la peau murine cellules dendritiques dans les ganglions lymphatiques de drainage lors de l&#39;infection avec<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Utilisation de cristallographie aux rayons X, biophysique, et des tests fonctionnels pour déterminer les mécanismes d&#39;administration des lymphocytes T Reconnaissance des récepteurs du cancer Antigènes

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...