Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

EJV wird durch ein Stipendium der Crohn s &amp; Colitis Foundation of America (CCFA) unterstützt. JRM wird durch Zuschüsse aus CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) und NIH Director s New Innovator Award unterstützt.

1. Ex-vivo-Generation von gut-Homing und Kontrolle T-Zellen (siehe Abbildung 1) <ol><li> Isolieren Splenozyten von Maischen ein Milz von Wildtyp-Mäusen. Resuspendieren der Zellen Suspension in PBS und zentrifugieren Sie für 5 &#39;bei 400 x g. Entfernen Sie den Überstand und lysieren die roten Blutkörperchen durch Resuspendieren des Zellpellets in 4 ml ACK-Lysepuffer für 2-3 Minuten. Danach werden 5 ml PBS. Zentrifugieren Sie für 5 &#39;bei 400 xg und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendier...

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	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

Obwohl Homing Experimente sehr wertvolle Informationen über die Migration des gesamten Zell-Populationen in einem bestimmten Gewebe zu schaffen, sollte es im Auge behalten werden, dass diese Tests nicht direkt analysieren endothelialen Adhäsion und daher nicht zu diskriminieren, in der Stufe (n) des mehrstufigen Haftung Kaskade (Tethering / Walz-, Aktivierungs-oder Kleben) eine gegebene Homing-Rezeptor wirkt. Der Goldstandard der spezifischen Rolle der Homing-Rezeptoren in die Haftung Kaskade zu definieren, ist Intrav...

Tiere: C57BL / 6 Mäuse werden häufig für T-Zell-Isolierung verwendet. Darüber hinaus sind CD45.1 und Thy1.1 kongene Stämme durch Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) zur Verfügung. Kulturmedien: IMDM (Iscove-Modified Dulbecco Medium + L-Glutamin + Hepes) plus 10% Hitze-inaktiviertes FBS (fötales Rinderserum, niedrige Endotoxin, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA) mit 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin (HyClone Antibiotika, Waltham, MA), 0,5 mg / ml Fungizone / Amphotericin B (Gibco) und 50 mM b-Mercaptoethanol. ACK Red Blood Cell Lysis-Puffer (RBC, 10 mM KHCO 3, 150 mM NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), auf pH 7,2-7,4 und bei Raumtemperatur lagern anpassen). PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA). Durchflusszytometrie (FACS) Medien (PBS oder IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). Wenn Färbung mit Selectin-Fc-Chimären, Medien mit 2 mM Ca + + soll in allen Stufen (einschließlich FACS-Akquisition) verwendet werden. IMDM ist in diesem Fall empfohlen. T-Zell-Kennzeichnung und adoptiven Transfer: CFSE (Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester), CMTMR ((5 - (und-6 )-((( 4-Chlormethyl) benzoyl) amino) Tetramethylrhodamin) von Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1000 x Vorräte sollten in DMSO hergestellt werden (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) und bei -20 ° C. Polyklonale T-Zell-Aktivierung: 24-well oder 96-well-Platten (Gewebe-Kultur behandelt, Polystyrol, mit flachem Boden mit Deckel, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) für 2 Stunden bei 37 ° C mit 50 ml PBS, jeweils inkubiert , mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörper (10 mg / ml). Dann werden Kulturplatten zweimal mit PBS gewaschen und sofort für die T-Zell-Kultur verwendet. Alternativ können Dynabeads mit anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) beschichtet für T-Zell-Aktivierung statt Platte gebundene Antikörper verwendet werden. Durchflusszytometrie (FACS) Färbung: polyklonale Aktivierung: CD3 (1452C11), CD28 (37,51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-Homing-Rezeptoren: gereinigtes CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), Isotyp-Kontrolle (IgG2a, k). Skin-Homing-Rezeptoren: P-Selektin-Fc (gereinigtes Maus P-Selectin - IgG-Fusionsprotein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-Selektin-Fc (rekombinantes Maus E-Selectin/Fc Chimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) plus entsprechende sekundäre Reagenz Ziege F (ab &#39;) 2 Anti-Human-IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). All-trans-Retinsäure (Sigma, St. Louis, MO) wird in absolutem Ethanol oder DMSO mit einer gelben Glühbirne oder eine indirekte Lichtquelle während der Vorbereitung resuspendiert. Shop-Aliquots in Glasflaschen bei -80 ° C und vor Licht geschützt zu allen Zeiten. Synthetische RAR-Agonisten: AM80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

Um ihre Funktion ausüben Lymphozyten benötigen, um das Blut zu verlassen und wandern in verschiedenen Geweben im Körper. Lymphozyten-Adhäsion an Endothelzellen und Gewebe Extravasation ist ein mehrstufiger Prozess durch verschiedene Adhäsionsmoleküle gesteuert (Homing-Rezeptoren) auf Lymphozyten und ihre jeweiligen Liganden (Addressine) auf Endothelzellen 1 2 angezeigt ausgedrückt. Obwohl die Funktion dieser Adhäsionsrezeptoren teilweise untersucht werden können ex vivo, der ultimative Test für ihre physiologische Relevanz ist, ihre Rolle bei der In-vivo-Lymphozyten Adhäsion und Migration zu bewerten. Intravitalmikroskopie (IVM) und Homing-Experimente: Zwei sich ergänzende Strategien sind für diesen Zweck verwendet worden. Obwohl IVM war wesentlich an den genauen Anteil der spezifischen Adhäsionsrezeptoren während die Haftung Kaskade in Echtzeit und in verschiedenen Geweben zu definieren, IVM zeitaufwendig und arbeitsintensiv ist, ist es oft erfordert die Entwicklung von anspruchsvollen chirurgischen Techniken, braucht es vor Isolierung von homogenen Zellpopulationen und es erlaubt die Analyse von nur einem Gewebe / Organ zu einem bestimmten Zeitpunkt. Im Gegensatz dazu ermöglichen wettbewerbsfähige Homing Experimente die direkte und gleichzeitige Vergleich bei der Migration von zwei (oder sogar mehr) Zellpopulationen in der gleichen Maus und sie erlauben auch die Analyse von vielen Geweben und einer hohen Anzahl von Zellen in das gleiche Experiment. Hier beschreiben wir die klassischen kompetitiven Homing-Protokoll verwendet, um den Vorteil / Nachteil eines bestimmten Zelltyp zu Hause, um spezifische Gewebe zu bestimmen, wie ein Steuerelement Zellpopulation verglichen. Wir entschieden uns für die Migration von gut-tropic gegenüber nicht gut-tropic T-Zellen zeigen, da die Darmschleimhaut ist die größte Körperoberfläche in Kontakt mit der äußeren Umgebung und es ist auch die extra-lymphatischen Gewebes mit den besten definierten wandernde Anforderungen . Darüber hinaus haben neuere Arbeiten festgestellt, dass die Vitamin-A-Metaboliten all-trans-Retinsäure (RA) die wichtigsten molekularen Mechanismus für die Induktion gut-spezifische Adhäsion Rezeptoren (Integrine a4b7and Chemokinrezeptor CCR9) auf Lymphozyten ist. So können wir ohne weiteres erzeugen eine große Anzahl von gut-tropischen und nicht gut-tropic Lymphozyten ex vivo durch Aktivierung von T-Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von RA, bzw., was schließlich in der Wettbewerbssituation Homing hier beschriebenen Experimente verwendet werden.

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Competitive Homing Experimente erlauben die direkte Beurteilung der wandernde Eigenschaften von zwei verschiedenen Zellpopulationen in einem einzigen Mausklick. Hier veranschaulichen wir dieses Verfahren durch einen Vergleich der Migration von ex vivo generierten gut-tropic versus nicht-gut tropic T-Zellen.

Competitive Homing-Assays auf Gut-trope T-Zell-Migration Study

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Eine quantitative Auswertung der Zellmigration durch die Phagokinetic Spur Motilität Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bazillus Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Mit Röntgenkristallographie, Biophysik, und funktionelle Assays zur Bestimmung der Mechanismen, die T-Zell-Rezeptor-Erkennung von Krebs-Antigene

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...