Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

EJV נתמך על ידי מענק מן ה-S &amp; קרוהן קוליטיס קרן של אמריקה (CCFA). JRM הוא נתמך על ידי מענקים CCFA, Cancer Research Institute (CRI), הווארד ח גודמן (MGH), מסצ&#39;וסטס Life Science Center (MLSC) ואת פרס ממציא ניו NIH של המנהל.

1. Ex vivo הדור של תאים T מעיים ביות ושליטה (ראה תרשים 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד splenocytes מוחצים one טחול מעכברים סוג בר. Resuspend ההשעיה תאים PBS ו צנטריפוגות במשך 5 &#39;ב 400 x ז הסר את supernatant ו lyse את כדוריות הדם האדומות על ידי resuspending התא גלולה של 4 מ&quot...

<ol>
	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

למרות ניסויים ביות לספק מידע בעל ערך רב על הגירה של אוכלוסיות תאים ברקמות סך נתון, יש לזכור כי מבחני אלו אינן ישירות לנתח הידבקות האנדותל, ולכן לא להפלות שבו צעד (ים) של הידבקות רב שלבי אשד (קשירה / מתגלגל, הפעלה או דבק) קולטן ביות נתון פועל. תקן הזהב להגדיר את התפקיד הספצ...

בעלי חיים: C57BL עכברים / 6 משמשים בדרך כלל עבור בידוד תא T. בנוסף, CD45.1 ו Thy1.1 זנים congenic זמינים דרך ג&#39;קסון מעבדות (בר הרבור, ME). תרבות התקשורת: IMDM (Medium השתנה Iscove של של Dulbecco + L-גלוטמין + Hepes) בתוספת 10% חום מומת FBS (עוברית שור רעלן פנימי סרום, נמוך, Gibco ®, Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מ&quot;ג / ml סטרפטומיצין (אנטיביוטיקה HyClone, Waltham, MA), 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​fungizone / amphotericin B (Gibco), ו - 50 מ&quot;מ ב-mercaptoethanol. תא דם אדום ACK תמוגה חיץ (RBC, 10 mM KHCO 3, 150 מ&quot;מ NH 4 Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), כדי להתאים את pH 7.2-7.4 ולאחסן בטמפרטורת החדר). PBS (פוספט בופר, Hyclone, Waltham, MA). Cytometry זרימה (FACS) מדיה (PBS או IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). כאשר מכתים באמצעות selectin-Fc מפלצות, התקשורת עם 2 mM Ca + + יש להשתמש בכל האמצעים (כולל רכישת FACS). IMDM מומלץ במקרה זה. T תיוג תא ולהעביר המאמצת: CFSE (diacetate carboxyfluorescein, succinimidyl אסתר), CMTMR ((5 - (ו-6 )-((( 4-chloromethyl) בנזואיל) אמינו) tetramethylrhodamine) מתוך בדיקות מולקולריות ®, Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה ). 1000 x במניות צריכה להתבצע DMSO (5 CFSE מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ CMTMR) ומאוחסנים ב -20 ° C. Polyclonal הפעלת תא T: 24-96-יפה או גם צלחות (רקמות תרבות מטופלים, קלקר, שטוחות תחתית עם מכסה, BD פלקון, פרנקלין לייקס, ניו ג&#39;רזי) מודגרת עבור 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם 50 מ&quot;ל PBS, בהתאמה , המכיל אנטי CD3 בתוספת אנטי CD28 נוגדנים (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​כל אחד). ואז, צלחות תרבות נשטפים פעמיים עם PBS ומשומשים מיד לתרבות תא T. לחלופין, Dynabeads מצופה anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) יכול לשמש להפעלת תא T במקום צלחת הנכנס נוגדנים. תזרים cytometry (FACS) מכתים: הפעלת polyclonal: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage MAB: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-ביות קולטנים: מטוהרים CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, סן דייגו, קליפורניה), a4b7 (LPAM-1/DATK3), אלוטיפ שליטה (IgG2a, יא). עור ביות קולטנים: P-selectin-Fc (מטוהרים מאוס P-selectin - חלבון IgG Fusion, BD Pharmingen, בסן חוזה, קליפורניה), E-selectin-Fc (E-Selectin/Fc עכבר רקומביננטי כימרה, R &amp; D מערכות, מיניאפוליס, MN) בתוספת עז המקביל משני מגיב F (ab &#39;) 2 אנטי אנושי IgG R-PE (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה). All-טרנס החומצה הרטינואית (Sigma, סנט לואיס, מיזורי) הוא resuspended באתנול DMSO מוחלטת או באמצעות נורה צהובה או מקור אור עקיף במהלך הכנת. Aliquots חנות בתוך צלוחיות זכוכית -80 מעלות צלזיוס ומוגן מפני אור בכל עת. Synthetic-RAR אגוניסטים: Am80 (Wako כימיקלים, ריצ&#39;מונד, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

על מנת להפעיל לימפוציטים תפקידם צריכים לעזוב את הדם ולנדוד לרקמות שונות בגוף. הידבקות הלימפוציטים לתאי האנדותל extravasation רקמות הוא תהליך רב שלבי נשלט על ידי מולקולות הדבקה שונות (קולטנים ביות) הביע על לימפוציטים ו ligands שלהם (addressins) מוצג לתאי אנדותל 1 2. אף על פי פונקציה של קולטנים אלה הדבקה ניתן ללמוד באופן חלקי לשעבר vivo, את המבחן האולטימטיבי רלוונטיות פיזיולוגיים שלהם הוא להעריך את תפקידם במהלך הידבקות ב לימפוציטים הגירה vivo ו. שתי אסטרטגיות משלימות שימשו למטרה זו: מיקרוסקופיה intravital (IVM) וניסויים ביות. למרות IVM כבר חיוני להגדיר את התרומה המדויקת של הידבקות קולטנים ספציפיים במהלך מפל הידבקות בזמן אמת ברקמות שונות, IVM היא זמן רב ועבודה אינטנסיבית, לעתים קרובות מחייב פיתוח של שיטות ניתוח מתוחכם, הוא צריך בידוד מראש של הומוגנית אוכלוסיות תאים וזה מאפשר ניתוח של איבר אחד בלבד רקמה / בכל זמן נתון. לעומת זאת, ניסויים ביות תחרותי לאפשר השוואה ישירה סימולטני הגירה של שני (או אפילו יותר) תת תא העכבר אותו והם גם היתר ניתוח של רקמות רבות של מספר גבוה של תאים בניסוי זהה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול קלאסית ביות תחרותי בשימוש כדי לקבוע את היתרון / חיסרון של סוג תא נתון לבית לרקמות ספציפיות לעומת האוכלוסייה תא שליטה. בחרנו להדגים את מאפייני הנדידה של טרופי בטן לעומת הלא קרביים טרופי בתאי T, כי רירית המעי הוא משטח הגוף הגדול ביותר במגע עם הסביבה החיצונית, והיא גם רקמת הלימפה במיוחד עם מיטב מוגדרים דרישות הנדידה . יתר על כן, העבודה האחרונה קבעה כי הוויטמין חומצה המטבוליט כל טרנס retinoic (ע&quot;ר) הוא המנגנון המולקולרי האחראי העיקרי גרימת בטן ספציפי קולטנים הידבקות (integrin קולטן a4b7and chemokine CCR9) על לימפוציטים. לפיכך, אנו יכולים בקלות ליצור מספר רב של vivo לשעבר מעיים טרופי ולא מעיים טרופי ידי הפעלת לימפוציטים ותאי T בנוכחות או היעדרו של RA, בהתאמה, אשר ניתן להשתמש בהם בסופו של דבר בניסויים ביות תחרותי המתואר כאן.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

ניסויים ביות תחרותי לאפשר ישירות להעריך את מאפייני הנדידה של שתי אוכלוסיות תאים שונות עכבר אחת. כאן אנו מדגימים הליך זה על ידי השוואת ההגירה לשעבר טרופי-vivo הבטן שנוצר לעומת אי - טי בטן תאים טרופי.

מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Assay CFSE המבוסס לחקר נדידת תאי דנדריטים עור Murine לתוך ניקוז בלוטות הלימפה במהלך זיהום<em&gt; Mycobacterium בוביס</em&gt; Bacille Calmette-גרן

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

באמצעות רנטגן קריסטלוגרפיה, ביופיזיקה, מבחנים תפקודיים לקביעת הכרת קולטן מנגנוני שלטון תאי T של אנטיגנים הסרטן

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...