Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
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EJV Crohn और बृहदांत्रशोथ फाउंडेशन अमेरिका के (CCFA) से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है. JRM CCFA, कैंसर अनुसंधान संस्थान (CRI), हावर्ड एच. Goodman (MGH), मैसाचुसेट्स जीवन विज्ञान केंद्र (MLSC) और एनआईएच के निदेशक नई अन्वेषक पुरस्कार से अनुदान द्वारा समर्थित है.

पेट घर वापस आना और नियंत्रण टी कोशिकाओं के एक पूर्व vivo पीढ़ी (चित्रा 1 देखें) <ol><li> जंगली प्रकार चूहों से एक तिल्ली mashing द्वारा splenocytes पृथक. 5 400 x जी &#39;पीबीएस में कोशिकाओं निलंबन और अपकेंद्रित्र Resuspend निकालें स?...

<ol>
	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

हालांकि घर वापस आना प्रयोगों किसी भी ऊतक में कुल सेल आबादियों के प्रवास के बारे में बहुत ही मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि इन assays सीधे endothelial आसंजन विश्लेषण नहीं करते हैं ?...

जानवर: C57BL 6 / चूहों आमतौर पर टी सेल अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाता है. इसके अलावा, CD45.1 और Thy1.1 congenic उपभेदों जैक्सन प्रयोगशालाओं (बार हार्बर, ME) के माध्यम से उपलब्ध हैं. संस्कृति मीडिया: (है Iscove संशोधित है Dulbecco + मध्यम एल-Glutamine Hepes +) IMDM प्लस 10% गर्मी - निष्क्रिय (भ्रूण गोजातीय सीरम कम endotoxin, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA के) FBS 100 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन के साथ पूरक, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (HyClone एंटीबायोटिक दवाओं, Waltham, MA), 0.5 मिलीग्राम / एमएल / fungizone amphotericin (Gibco) बी, और 50 मिमी ख mercaptoethanol. ACK लाल रक्त कोशिका lysis बफर (आरबीसी, 10 मिमी KHCO 3, 150 मिमी एनएच 4 सीएल, 0.1 मिमी EDTA, पीएच 8.0), 7.2-7.4 पीएच और कमरे के तापमान पर दुकान करने के लिए समायोजित ). पीबीएस (फास्फेट खारा, Hyclone, Waltham, MA buffered). प्रवाह cytometry (FACS) मीडिया (पीबीएस या IMDM + 2% FBS + 5 मिमी EDTA). जब 2 मिमी Ca के साथ selectin-एफसी chimeras, मीडिया का उपयोग कर धुंधला + + सभी चरणों (FACS अधिग्रहण सहित) में किया जाना चाहिए. IMDM इस मामले में सिफारिश की है. टी सेल लेबलिंग और दत्तक हस्तांतरण: CFSE (carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl एस्टर), CMTMR ((5 - (और छह )-((( 4 chloromethyl) benzoyl) एमिनो) आण्विक जांच से tetramethylrhodamine) ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). X 1000 शेयरों DMSO में बनाया जाना चाहिए (5 मिमी CFSE, 20 मिमी CMTMR) और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत पॉलीक्लोनल टी सेल सक्रियण: 24 अच्छी तरह से या 96 अच्छी तरह प्लेटें (इलाज ऊतक संस्कृति, polystyrene, ढक्कन के साथ फ्लैट नीचे, बी.डी. फाल्कन, फ्रेंकलिन Lakes, NJ) 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के साथ 50 मिलीलीटर पीबीएस क्रमशः incubated हैं विरोधी CD3 प्लस विरोधी CD28 एंटीबॉडी (10 मिलीग्राम / एमएल प्रत्येक) से युक्त है. फिर, संस्कृति प्लेटें पीबीएस के साथ दो बार धो रहे हैं और टी सेल संस्कृति के लिए तुरंत इस्तेमाल किया. वैकल्पिक रूप से, anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) के साथ लेपित Dynabeads थाली बाध्य एंटीबॉडी के बजाय टी सेल सक्रियण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रवाह cytometry धुंधला (FACS): पॉलीक्लोनल सक्रियण: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). वंश MAB: सीडी 4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). आंत घर वापस आना रिसेप्टर्स: शुद्ध CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, सैन डिएगो, सीए), a4b7 (LPAM-1/DATK3), निर्धारण नियंत्रण (IgG2a कश्मीर). त्वचा घर वापस आना रिसेप्टर्स: पी selectin-एफसी (शुद्ध पी selectin माउस - सीए आईजीजी फ्यूजन प्रोटीन, बी.डी. Pharmingen, सैन जोस,), ई selectin-एफसी (पुनः संयोजक माउस E-Selectin/Fc कल्पना, अनुसंधान एवं विकास सिस्टम, Minneapolis, ) एम.एन. प्लस इसी माध्यमिक अभिकर्मक बकरी एफ (अब &#39;) 2 मानव विरोधी आईजीजी आर पीई (Invitrogen, Carlsbad, CA). अखिल पार retinoic एसिड (सिग्मा, सेंट लुइस, MO) निरपेक्ष इथेनॉल या DMSO के एक पीला बल्ब या तैयारी के दौरान प्रकाश की एक अप्रत्यक्ष स्रोत का उपयोग कर में resuspended है. स्टोर aliquots -80 पर कांच की शीशियों में डिग्री सेल्सियस और हर समय प्रकाश से सुरक्षित है. सिंथेटिक RAR-agonists: Am80 (Wako रसायन, रिकमंड, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

प्रतियोगी घर वापस आना प्रयोगों के लिए सीधे एक माउस में दो अलग अलग सेल आबादी के प्रवासी गुण का आकलन करने की अनुमति देते हैं. यहाँ हम पूर्व vivo उत्पन्न आंत - रेखा बनाम गैर पेट रेखा टी कोशिकाओं के प्रवास की तुलना द्वारा इस प्रक्रिया का वर्णन.

प्रतियोगी घर वापस आना Assays आंत रेखा टी सेल प्रवासन अध्ययन

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

मानव टी लिम्फोसाइट अलगाव, और प्रवासन की संस्कृति विश्लेषण इन विट्रो में</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

ल्युकोसैट घर वापस आना और प्रवासन की गैर इनवेसिव इमेजिंग Vivo में</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

माउस टी कोशिकाओं में टी सेल रिसेप्टर्स की रेट्रोवायरल transduction

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Phagokinetic ट्रैक गतिशीलता परख से एक सेल प्रवास के मात्रात्मक मूल्यांकन

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

अनुभवहीन सीडी 4 की adenoviral पारगमन Treg भेदभाव का अध्ययन करने के लिए कोशिकाओं टी

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

चूहे में allogeneic सीडी 4 टी सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए तेल त्वचा का प्रत्यारोपण

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

माउस भोले सीडी 4<sup&gt; +</sup&gt; टी सेल अलगाव और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; टी सेल सबसेट में भेदभाव

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

सूजन डर्मिस में इमेजिंग सीडी 4 टी सेल बीचवाला प्रवासन

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Draining लिम्फ नोड्स में Murine त्वचा वृक्ष के समान कोशिकाओं के प्रवास का अध्ययन करने के साथ संक्रमण के दौरान एक CFSE आधारित परख<em&gt; माइकोबैक्टीरियम बोविस</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

का उपयोग करते हुए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, बायोफिजिक्स, और कार्यात्मक assays तंत्र शासी टी-सेल कैंसर प्रतिजनों की रिसेप्टर मान्यता निर्धारित करने के लिए

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...