Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

EJV è sostenuto da una borsa di studio L&#39;s &amp; colite di Crohn Foundation of America (CCFA). JRM è supportato anche da finanziamenti CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) e Innovator Award nuovo direttore del NIH s.

1. Generazione ex vivo di cellule T gut-homing e di controllo (vedi Figura 1) <ol><li> Isolare splenociti da schiacciare uno milza di topi wild-type. Risospendere la sospensione le cellule in PBS e centrifugare per 5 &#39;a 400 x g. Rimuovere il supernatante e lisare i globuli rossi da risospendere il pellet in 4 ml di tampone di lisi ACK per 2-3 minuti. Dopo di che, aggiungere 5 ml di PBS. Centrifugare per 5 &#39;a 400 xg ed eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere splenociti totale a 1 x 10 6</s...

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	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

Anche se gli esperimenti di homing fornire informazioni molto importanti sulla migrazione di popolazioni di cellule totali in qualsiasi tessuto dato, va tenuto presente che questi test non direttamente analizzare l&#39;adesione endoteliale e, pertanto, che non discriminino in cui passo (s) del adesione multistep cascata (tethering / a rotazione, l&#39;attivazione o attaccare), un recettore dato homing agisce. Il gold standard per definire il ruolo specifico dei recettori di homing in cascata l&#39;adesione è microscopi...

Animali: topi C57BL / 6 sono comunemente usati per l&#39;isolamento delle cellule T. Inoltre, CD45.1 e Thy1.1 ceppi congenic sono disponibili attraverso Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Cultura dei media: IMDM (Medium Iscove di modifica Dulbecco + L-Glutamina + Hepes) più 10% di siero FBS (Fetal Bovine Serum, endotossine basse, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA) integrata con 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina (antibiotici Hyclone, Waltham, MA), 0,5 mg / ml Fungizone / amfotericina B (Gibco), e 50 mm b-mercaptoetanolo. ACK Red Cell Lysis buffer di sangue (globuli rossi, 10 mM KHCO 3, 150 mM NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), portato a pH 7,2-7,4 e conservare a temperatura ambiente). PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA). Citometria a flusso (FACS), media (PBS o IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). Quando colorazione utilizzando selectina-Fc chimere, mezzi di comunicazione con 2 mM Ca + + deve essere usato in tutte le misure (compresa l&#39;acquisizione FACS). IMDM è raccomandato in questo caso. Etichettatura delle cellule T e adottiva di trasferimento: CFSE (diacetato carboxyfluorescein, succinimidile estere), CMTMR ((5 - (e-6 )-((( 4-clorometil) benzoile) ammino) tetrametilrodamina) da Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1000 x scorte dovrebbe essere effettuata in DMSO (5 CFSE mm, 20 mm CMTMR) e conservati a -20 ° C. Policlonale attivazione delle cellule T: 24-bene o piastre a 96 pozzetti (tessuto-coltura trattata, polistirolo, a fondo piatto con coperchio, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) vengono incubate per 2 ore a 37 ° C con 50 ml di PBS, rispettivamente , contenente anti-CD3 più anticorpi anti-CD28 (10 mg / mL). Poi, piastre di coltura vengono lavate due volte con PBS e utilizzato immediatamente per la coltura delle cellule T. In alternativa, Dynabeads rivestito con anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) possono essere utilizzati per l&#39;attivazione delle cellule T, invece di piatto legato anticorpi. Citometria a flusso (FACS) colorazione: attivazione policlonali: CD3 (1452C11), CD28 (37,51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing recettori: purificato CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotipo di controllo (IgG2a, k). Skin-homing recettori: P-selectina-Fc (depurata del mouse P-selectina - proteina di fusione IgG, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectina-Fc (E-Selectin/Fc mouse ricombinante Chimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN), più corrispondente secondaria F capra reagente (ab &#39;) 2 anti-IgG umane R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). Acido all-trans retinoico (Sigma, St. Louis, MO) è risospeso in etanolo assoluto o DMSO utilizzando una lampadina gialla o una fonte indiretta di luce durante la preparazione. Aliquote Conservare in flaconi di vetro a -80 ° C e al riparo dalla luce in ogni momento. Sintetico RAR-agonisti: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

Al fine di esercitare la loro funzione di linfociti bisogno di lasciare il sangue e migrare in vari tessuti del corpo. Adesione dei linfociti alle cellule endoteliali e lo stravaso del tessuto è un processo a più fasi controllate da molecole di adesione diversi (recettori di homing) ha espresso sui linfociti e le loro rispettive ligandi (addressins) visualizzati sulle cellule endoteliali 1 2. Anche se la funzione di questi recettori di adesione può essere parzialmente studiati ex vivo, l&#39;esame finale per la loro rilevanza fisiologica è quello di valutare il loro ruolo in vivo durante l&#39;adesione e la migrazione dei linfociti. Due strategie complementari sono state utilizzate per questo scopo: microscopia intravitale (IVM) e gli esperimenti di homing. Anche se IVM è stato essenziale per definire il contributo preciso di recettori di adesione specifici durante la cascata adesione in tempo reale e in diversi tessuti, IVM richiede tempo e lavoro intensivo, spesso richiede lo sviluppo di sofisticate tecniche chirurgiche, ha bisogno di isolamento prima di omogenea popolazioni di cellule e permette l&#39;analisi di un solo tessuto / organo in un dato momento. Al contrario, competitivo esperimenti di homing consentono il confronto diretto e simultaneo nella migrazione di due (o più) sottoinsiemi cellula lo stesso mouse e permettono anche l&#39;analisi di molti tessuti e di un elevato numero di cellule nel medesimo esperimento. Qui si descrive il classico protocollo di homing competitivo utilizzato per determinare il vantaggio / svantaggio di un tipo di cellula dato casa ai tessuti specifici rispetto ad una popolazione di cellule di controllo. Abbiamo scelto di illustrare le proprietà migratorie di gut-tropico rispetto a non gut-tropico cellule T, perché la mucosa intestinale è la superficie più grande corpo a contatto con l&#39;ambiente esterno ed è anche l&#39;olio extra-tessuto linfoide con il meglio definiti i requisiti migratori . Inoltre, un recente lavoro ha stabilito che la vitamina A metabolita acido all-trans retinoico (RA) è il principale meccanismo molecolare responsabile per indurre gut-specifici recettori di adesione (integrine recettori delle chemochine a4b7and CCR9) sui linfociti. Quindi, possiamo facilmente generare un gran numero di gut-tropico e non gut-tropico linfociti ex vivo, attivando le cellule T, in presenza o assenza di RA, rispettivamente, che possono essere finalmente utilizzati negli esperimenti di homing competitivo qui descritto.

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Esperimenti di homing competitivo permettono di valutare direttamente le proprietà migratorie di due diverse popolazioni cellulari in un mouse. Qui illustrare questa procedura confrontando la migrazione di ex vivo generata gut-tropico rispetto a non-intestinali cellule T tropico.

Competitivo saggi Homing allo Studio Gut-tropico Migrazione cellulare T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Isolamento linfociti T umani, la cultura e l&#39;analisi delle migrazioni In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Una valutazione quantitativa della migrazione cellulare con il Test Phagokinetic motilità Traccia

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Il trapianto di coda della pelle per studiare allogenico di cellule T CD4 risposte in topi

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Un test CFSE-based per studiare la migrazione delle cellule dendritiche murini della pelle in drenanti linfonodi durante l&#39;infezione con<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Utilizzando cristallografia a raggi X, Biofisica, e saggi funzionali per determinare i meccanismi di amministrazione delle cellule T del recettore Riconoscimento di cancro antigeni

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...