Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

EJVは、アメリカのクローン病S＆大腸炎財団（CCFA）のフェローシップでサポートされています。 JRMはCCFA、がん研究所（CRI）、ハワードH.グッドマン（MGH）、マサチューセッツ州ライフサイエンスセンター（MLS​​C）とNIHのディレクターの新イノベーター賞からの補助金によってサポートされています。

腸管ホーミングと制御性T細胞（図1参照）1。 生体外での発生<ol><li>野生型マウスから一脾臓を糖化により、脾細胞を分離します。 5&#39;400 × gでのためにPBSと遠心で細胞懸濁液を懸濁します上清を除去し、2〜3分のためのACK溶解緩衝液を4 mlに細胞ペレットを再懸濁することにより赤血球を溶解する。その後、PBS 5 mlを加える。 400 xgで5&#39;間遠心し上清を取り除く。 </li><li> 1 × 10 IMDM ...

<ol>
	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

ホーミングの実験は、任意の組織の全細胞集団の移行についての非常に貴重な情報を提供していても、それはこれらのアッセイは、直接血管内皮の接着性を分析していないため、多段階の接着性の中のステップ（複数可）を区別しないことを心に留めておく必要がありますカスケード（ローリング/テザリング、活性化または付着）所定のホーミング受容体が機能しています。接着カスケード...

動物：C57BL / 6マウスは、一般的にT細胞の単離に使用されています。さらに、CD45.1とThy1.1コンジェニック系統は、ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）を介して使用できます。 文化メディア：IMDM（イスコフ改変ダルベッコ培地+ L -グルタミン+ HEPES）を加えた10％ 熱不活性 100 U / mlペニシリンを添加したFBS（ウシ胎児血清、低エンドトキシン、GIBCO ®、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）、100 mgの/ mlのストレプトマイシン（HyCloneの抗生物質、ウォルサム、MA）、0.5 mg / mlのfungizone /アンホテリシンB（Gibco社）、および50mMのβ-メルカプトエタノール。 ACK赤血球溶解バッファー （RBC、10mMのKHCO 3、150mMのNH 4 Clを、0.1mMのEDTA、pHは8.0）、室温でpHを7.2から7.4とストアに調整します）。 PBS（リン酸生理食塩水、Hyclone、ウォルサム、マサチューセッツバッファ）。 フローサイトメトリー（FACS）メディア （PBSまたはIMDM + 2％FBS + 5mMのEDTA）。セレクチン- Fcをキメラを用いて染色する場合、2 mMのカルシウムを持つメディアは+ +のすべてのステップ（FACSの買収を含む）で使用する必要があります。 IMDMはこのケースで推奨されます。 T細胞標識と養子移入：CFSE（カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル）、CMTMR -分子プローブ®、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州から（（5（および6 )-((( 4 -クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン） ）。 1000 ×株をDMSOに作ら（5mMのCFSE、20mMのCMTMR）と-20℃で保存してください。 ポリクローナルT細胞の活性化 ：24ウェルまたは96ウェルプレート（組織培養処理された、蓋付き平底ポリスチレン、、BDファルコン、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）は、℃で50 mlのPBS、それぞれ37℃で2時間インキュベートする、抗CD3 +抗CD28抗体（10 mg / mLの各）を含む。その後、培養プレートをPBSで2回洗浄し、T細胞培養のためにすぐに使用。また、anti-CD3/anti-CD28（DYNAL、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）で被覆されたダイナビーズは、代わりにプレート結合抗体のT細胞活性化のために使用することができます。 フローサイトメトリー（FACS）染色：ポリクローナル活性化：CD3（1452C11）、CD28（37.51）。リネージュモノクローナル抗体：CD4（L3T4）、CD8a（LY - 2）、Thy1.2（CD90.2/53-1.2）、CD45.2（104）。腸管ホーミング受容体：精製CCR9（CD199/eBioCW-1.2、eBioscience社、サンディエゴ、CA）、a4b7（LPAM-1/DATK3）、アイソタイプコントロール （IgG2aの、K）。皮膚ホーミングレセプター：P -セレクチン- Fcの （精製マウスP -セレクチン- IgGの融合蛋白質、BD Pharmingen社、サンノゼ、カリフォルニア州）、E -セレクチン- Fcの （組換えマウスのE-Selectin/Fcキメラ、R＆Dシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）に加えて、対応する二次試薬ヤギF（ab&#39;）2の抗ヒトIgG R - PE（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）。 全トランスレチノイン酸（シグマ社、セントルイス、MO）準備中に黄色の電球や光の間接的なソースを使用して無水エタノールやDMSOに再懸濁する。 -80℃のガラスバイアルに保管してアリコート° Cとすべての回で光から保護。合成RAR -アゴニスト：Am80（和光ケミカル、リッチモンド、バージニア州）。

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

それらの機能リンパ球を発揮するために血液を離れて、体内の異なる組織に移行する必要があります。内皮細胞と組織の溢出にリンパ球の接着は、リンパ球と内皮細胞1 2上に表示されるそれぞれのリガンド（アドレシン）に発現する別の接着分子によって制御される多段階プロセス（ホーミング受容体）である。これらの接着受容体の機能が部分的にex vivoで検討することができるにもかかわらず、それらの生理的関連性の究極のテストは、 生体内リンパ球の接着および遊走の中に自分の役割を評価することである。生体顕微鏡（IVM）とホーミングの実験：二つの補完的な戦略は、この目的のために使用されています。 IVMは、リアルタイムで、異なる組織の接着カスケード時に特定の接着受容体の正確な寄与を定義するために必要不可欠なってきていますが、IVMは時間がかかり、労働集約的であり、それはしばしば、高度な手術手技の開発を必要とする、それは均質の前の分離が必要細胞集団と、それは任意の時点で唯一の組織/臓器の分析を可能にします。これとは対照的に、競争力のあるホーミングの実験では、同じマウスの2つ（あるいはそれ以上）細胞サブセットの移行における直接的と同時比較が可能となり、彼らはまた、多くの組織のと同じ実験中の細胞の数が多いの分析を可能にする。 ここでは、コントロール細胞集団と比較して、特定の組織へホームへ所定の細胞型の利点/欠点を決定するために使用される古典的な競争力のあるホーミングプロトコルについて説明します。腸の粘膜が外部環境と接触する最大の身体の表面であり、それはまた最高の定義の渡り鳥要件を持つ追加のリンパ組織であるので、我々は、腸管指向性に対する腸管指向性以外のT細胞の遊走特性を説明するために選んだ。また、最近の研究では、ビタミンが代謝オールトランスレチノイン酸（RA）がリンパ球上に腸に特異的な接着受容体（インテグリンa4b7andのケモカイン受容体CCR9）を誘導に関与する主要分子機構であると判断しました。従って、我々は容易にようやくここで説明する競争力のあるホーミングの実験で使用することができる、それぞれ、RAの存在下または非存在下でT細胞を活性化することによって腸指向性とリンパ球腸管指向性非ex vivoでの多数を生成することができます。

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

競争力のあるホーミングの実験は、直接、単一のマウスの2つの異なる細胞集団の遊走特性を評価することができます。ここでは、生体外で生成された腸管指向性と非腸熱帯T細胞の遊走を比較することによって、この手順を示しています。

腸管指向性T細胞の移動を研究するために競争力のあるホーミングアッセイ

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

ナイーブCD4のアデノウイルス形質導入Tregの分化を研究するためにT細胞

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

マウスにおける同種のCD4 T細胞応答を研究する尾皮膚の移植

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

での感染の間に流入領域リンパ節へのマウスの皮膚樹状細胞の移動を研究するためにCFSEベースアッセイ<em&gt;マイコバクテリウム・ボビス</em&gt;カルメット - ゲラン

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

がん抗原の機構理事T細胞受容体の認識を決定するためにX線結晶学、生物物理学、および機能アッセイを使用して、

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...