Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
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EJV는 미국의 Crohn S &amp; 대장염 재단 (CCFA)의 화목에 의해 지원됩니다. JRM은 CCFA, 암 연구소 (크리), 하워드 H. 굿맨 (MGH), 매사 추세츠 생명 과학 센터 (MLSC)와 NIH 원장의 새로운 이노 수상의 기금에 의해 지원됩니다.

인내심을 추적 및 제어 T 세포 1. 전의 생체내 생성 (그림 1 참조) <ol><li> 야생 타입 마우스로부터 비장을 mashing하여 splenocytes를 분리. 5 &#39;400 X G.에 대한 세포의 PBS의 서스펜션과 원심 분리기를 Resuspend 뜨는을 제거 후 2-3 분 동안 ACK 용해 완충액 4 ML에있는 세포 펠렛을 resuspending하여 적혈구를 lyse. 그 후, PBS 5 ML를 추가합니다. 5 &#39;400 XG에 대한 원심 분리기 및 뜨는을 제거하십시오. </li><li> 1 ...

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	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

유도 실험 특정 조직에서 전체 세포 인구의 마이 그 레이션하는 것에 대한 매우 귀중한 정보를 제공하더라도, 그것은 이러한 assays 직접 내피 접착력을 분석하지 않으며 따라서 차별하지 않는 마음에 보관되어야하는 다단계 부착의 어느 단계 (S)에 캐스케이드 (tethering / 인증 또는 고집 롤링) 지정된 추적 수용체는 행동이다. 유착 층계에 들어가고 수용체의 특정 역할을 정의하는 황금 표준은 개별 ...

동물 : C57BL / 6 마우스는 일반적으로 T 세포 절연을 위해 사용됩니다. 또한, CD45.1 및 Thy1.1 congenic 계통 잭슨 연구소 (바 하버, ME)를 통해 사용할 수 있습니다. 문화 미디어 : IMDM (Iscove의 수정 Dulbecco의 중간 + L - 글루타민 + Hepes) 플러스 10% 열 inactivated 100 U / ML 페니실린과 보충 FBS (태아 소 혈청, 낮은 내독소, Gibco ®, Invitrogen, 칼스 배드, CA), 100 MG / ML 스트렙토 마이신 (항생제의 HyClone, 월섬, MA), 0.5은 MG / ML fungizone / amphotericin B (Gibco), 50 MM B - 메르 캅 토 에탄올. ACK 적혈구 세포 용해 버퍼 (RBC, 10 MM KHCO 3, 150 MM NH 4 Club 호텔, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0)) 산도 7.2-7.4와 실온에서 저장을 조절할 수 있습니다. PBS (인산이 살린, Hyclone, 월섬, MA를 버퍼). 유동세포계측법 (외과) 미디어 (PBS 또는 IMDM + 2퍼센트 FBS + 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 이 MM CA와 Selectin - FC chimeras, 미디어를 사용하면 얼룩 + + 모든 단계 (외과 인수 포함)에 사용해야합니다. IMDM이 경우에 권장합니다. T 세포 라벨링 및 입양 전송 : CFSE (carboxyfluorescein 디아 세 테이트, succinimidyl 에스테르), CMTMR - 분자 프로브에서 ((5 (그리고 - 6 )-((( 4 - chloromethyl) 벤조일) 아미노) tetramethylrhodamine) ®, Invitrogen, 칼스 배드, CA ). 1000 X 주식은 DMSO로 작성 (5 MM의 CFSE, 20 MM CMTMR)와 -20 ° C.에 보관해야 Polyclonal T 세포 활성화 : 24 - 글쎄 또는 96 - 웰 플레이트는 (조직 문화 처리, 뚜껑이있는 평면 바닥 폴리스티렌, BD 팔콘, 프랭클린 레이크스, NJ)는 ° C와 50 ML PBS, 각각 37에서 2 시간 동안 incubated 아르 , 안티 인 경우에는 3 번 CD 플러스 안티 CD28 항체 (10 MG / ML 각)이있는. 그런 다음, 문화 플레이트는 PBS로 두 번 씻어하고 T 세포 문화의 즉시 사용됩니다. 또는 anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, 칼스 배드, CA)로 코팅 Dynabeads 대신 판 - 바운드 항체의 T 세포 활성화에 사용할 수 있습니다. 유동세포계측법 (외과) 얼룩 : Polyclonal 인증 : 인 경우에는 3 번 CD (1452C11), CD28 (37.51). 리니지 mAb : CD4 (L3T4), CD8a (LY - 2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). 인내심을 유도 수용체 : 정화 CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, 샌디에고, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotype 제어 (IgG2a, K). 피부 유도 수용체 : P - selectin - FC (정화 마우스 P - Selectin - IgG의 융합 단백질, BD Pharmingen, 산호세, CA), E - selectin - FC (재조합 마우스 E-Selectin/Fc 치메라, ​​R &amp; D 시스템, 미네 아 폴리스, MN) 플러스 해당 보조 시약의 염소 F (AB &#39;) 2 안티 인간 IgG R - PE (Invitrogen, 칼스 배드, CA). 모든 트랜스 retinoic 산이 (시그마, 세인트 루이스, MO) 준비 중에 노란색 전구 또는 조명의 간접 소스를 사용하여 절대 에탄올 또는 DMSO에 resuspended 있습니다. -80에서 유리 튜브 안에 저장 aliquots ° C와 항상 빛으로부터 보호. 합성 RAR - agonists : Am80 (와코 화학 물질, 리치몬드, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

발휘하기 위해서는 자신의 기능 lymphocytes은 혈액을두고 신체의 다른 조직으로 마이 그 레이션해야합니다. 내피 세포 및 조직 넘쳐 흐름에 림프구 접착력이 lymphocytes과 내피 세포 1 2에 표시된 각각의 리간드 (addressins)에 표시 다른 접착 분자에 의해 통제 다단계 프로세스 (유도 수용체)입니다. 이러한 유착 수용체의 기능이 부분적으로 공부를 할 수 있지만 전 생체내 자신의 생리 관련에 대한 궁극적인 시험은 생체내 림프구 접착 및 마이 그 레이션에 동안 자신의 역할을 평가하는 것입니다. intravital 현미경 (IVM)과 유도 실험 : 두 개의 상호 보완적인 전략이 목적을 위해 사용되었습니다. IVM은 실시간으로 가능하고 다른 조직에 유착 폭포 중 특정 유착 수용체의 정확한 기여를 정의하는 필수되어 있지만, IVM은 집중 시간이 소요과 노동, 그것은 종종 정교한 수술 기법의 개발이 필요, 그것은 단일의 사전 격리 필요 세포 인구와 어떤 주어진 시간에 하나의 조직 / 기관의 분석을 수 있습니다. 반대로, 경쟁 유도 실험 같은 마우스의 두 마이 그 레이션 (혹은 이상) 셀 집합에 직접적이고 동시 비교를 허용하지 않으며 그들은 또한 많은 조직과 같은 실험에서 세포의 높은 숫자의 분석을 허용합니다. 여기서 우리는 제어 셀 인구에 비해 같은 특정 조직에 집으로 주어진 세포 유형의 장점 / 단점을 확인하는 데 사용되는 전통적인 경쟁 유도 프로토콜을 설명합니다. 창자 점막이 외부 환경과의 접촉에서 가장 큰 몸 표면이기 때문에 우리는 인내심을 트로픽 대 인내심 트로픽 비 T 세포의 철새 속성을 설명하기 위해 선택하고 또한 최고의 정의 철새 요구 사항을 추가 - 림프 조직이다 . 또한, 최근의 작품은 비타민이 신진 대사 모든 트랜스 retinoic 산 (RA)는 lymphocytes에 창자가 특정 유착 수용체 (인테 a4b7and의 케모카인 수용체 CCR9)를 유도에 대한 책임의 기본 분자 메커니즘 것을 확인했습니다. 따라서, 우리는 쉽게 드디어 여기에서 설명한 경쟁 유도 실험에서 사용할 수있는 각각 RA의 존재 또는 부재의 T 세포를 활성화하여 인내심을 트로픽 및 lymphocytes 인내심 트로픽 비 예 생체내 다수를 생성할 수 있습니다.

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

경쟁 유도 실험 직접 하나의 마우스로 두 개의 서로 다른 세포 인구의 철새 속성을 평가하실 수 있습니다. 여기 우리는 전 생체내 생성 인내심 트로픽 대 비 직감 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 비교하여이 절차를 설명합니다.

굿 - 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 Assays

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

마우스에 동종 CD4 T 세포 반응을 연구하기 위해 테일 피부 이식

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석<em&gt; 소 결핵균</em&gt; Bacille 칼 메트 - GUERIN

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...