Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

EJV é apoiado por uma bolsa da s &amp; Colite de Crohn Foundation of America (CCFA). JRM é suportado por concessões do CCFA, Cancer Research Institute (CRI), H. Howard Goodman (MGH), Life Science Center Massachusetts (MLSC) e Prêmio NIH Director s New Innovator.

1. Geração ex vivo de células T gut-homing e controle (ver Figura 1) <ol><li> Isolar esplenócitos por mashing um baço de camundongos de tipo selvagem. Volte a suspender as células em suspensão PBS e centrifugar por 5 &#39;a 400 x g. Remover o sobrenadante e lise das células vermelhas do sangue pela ressuspensão do pellet celular em 4 ml de tampão de lise ACK por 2-3 minutos. Depois disso, adicione 5 ml de PBS. Centrifugar por 5 &#39;a 400 xg e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender esplenóc...

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	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

Apesar de experimentos homing fornecer informações valiosas sobre a migração de populações de células totais em qualquer dado tecido, ele deve ser mantido em mente que estes ensaios não analisam diretamente adesão endotelial e, portanto, não discriminar em qual etapa (s) da adesão de várias etapas cascata (tethering / rolamento, ativação ou furar) um determinado receptor homing está agindo. O padrão ouro para definir o papel específico dos receptores de homing na cascata de adesão é de microscopia int...

Animais: camundongos C57BL / 6 são comumente usados ​​para o isolamento de células T. Além disso, CD45.1 e Thy1.1 linhagens congênitas estão disponíveis através de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Cultura da mídia: IMDM (Medium Modificado Iscove de Dulbecco + L-Glutamina + Hepes) acrescido de 10% inativado pelo calor FBS (fetal bovino endotoxina, Serum baixa, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 100 U / penicilina ml, 100 mg / ml de estreptomicina (antibióticos HyClone, Waltham, MA), 0,5 mg / ml Fungizone / anfotericina B (Gibco) e 50 mM b-mercaptoetanol. ACK Red Blood tampão de lise celular (RBC, 10 mM KHCO 3, 150 mM NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), ajustado a pH 7,2-7,4 e armazenar em temperatura ambiente). PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA). Citometria de fluxo (FACS) media (PBS ou IMDM + 2 + 5% FBS mM EDTA). Quando coloração com Selectina-Fc quimeras, media com 2 mM Ca + + deve ser usado em todas as etapas (incluindo a aquisição FACS). IMDM é recomendado neste caso. T rotulagem celular e transferência adotiva: CFSE (carboxifluoresceína diacetato, succinimidyl éster), CMTMR ((5 - (e-6 )-((( 4-clorometil) benzoil) amino) tetrametilrodamina) de Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1.000 ações x deve ser feita em DMSO (5 CFSE mM, 20 mM CMTMR) e armazenadas a -20 ° C. Ativação de células T policlonais: 24 bem ou placas de 96 poços (cultura de tecidos tratados, poliestireno, de fundo plano com tampa, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) são incubados por 2 horas a 37 ° C com 50 ml de PBS, respectivamente , contendo anti-CD3, mais anti-CD28 anticorpos (10 mg / mL cada). Então, placas de cultura são lavados duas vezes com PBS e imediatamente utilizado para cultura de células T. Alternativamente, Dynabeads revestido com anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) pode ser usada para ativação das células T, em vez de placa-bound anticorpos. Citometria de fluxo coloração (FACS): ativação policlonal: CD3 (1452C11), CD28 (37,51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptores: purificada CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotipo controle (IgG2a, k). Pele-homing receptores: P-selectina-Fc (Purified rato P-Selectina - IgG proteína de fusão, BD PharMingen, San Jose, CA), E-selectina-Fc (E-Selectin/Fc rato recombinante Chimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN), mais de cabra F correspondente secundário reagente (ab &#39;) 2 anti-humano IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). All-trans ácido retinóico (Sigma, St. Louis, MO) é ressuspenso em etanol absoluto ou DMSO usando uma lâmpada amarela ou uma fonte indireta de luz durante a preparação. Alíquotas armazenar em frascos de vidro a -80 ° C e protegida da luz em todos os momentos. Sintéticos RAR-agonistas: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

A fim de exercer sua função linfócitos necessidade de deixar o sangue e migram para diferentes tecidos no organismo. Adesão dos linfócitos às células endoteliais e extravasamento de tecido é um processo de várias etapas controladas por diferentes moléculas de adesão (receptores homing) expressa em linfócitos e seus ligantes respectivos (addressins) exibidos em células endoteliais 1 2. Mesmo que a função desses receptores de adesão pode ser parcialmente estudou ex vivo, o teste final para sua relevância fisiológica é avaliar o seu papel durante na adesão de linfócitos vivo e migração. Duas estratégias complementares têm sido utilizados para esse fim: microscopia intravital (IVM) e experimentos homing. Embora IVM tem sido essencial para definir a contribuição precisa de receptores de adesão específicos durante a cascata de adesão em tempo real e em diferentes tecidos, IVM é demorado e trabalhoso, que muitas vezes requer o desenvolvimento de sofisticadas técnicas cirúrgicas, que necessita de isolamento antes de homogêneo populações de células e permite a análise de apenas um órgão, tecido / a qualquer momento. Pelo contrário, competitiva experimentos homing permitir a comparação direta e simultânea na migração de duas (ou mais) em subpopulações de células com o mouse mesmo e eles também permitem a análise de muitos tecidos e de um elevado número de células no mesmo experimento. Aqui nós descrevemos o protocolo competitivo clássica homing usado para determinar a vantagem / desvantagem de um tipo de célula dado a casa para tecidos específicos, em comparação com uma população de células controle. Escolhemos para ilustrar as propriedades migratórias do intestino trópico-versus células não gut trópico-T, porque a mucosa intestinal é a superfície maior corpo em contato com o ambiente externo e também é o tecido extra-linfóides com os requisitos definidos pelo melhor migratórias . Além disso, trabalhos recentes determinou que a vitamina A, ácido all-trans retinóico metabólito (RA) é o principal mecanismo molecular responsável pela indução de receptores específicos gut-adesão (integrinas receptor de quimiocina a4b7and CCR9) em linfócitos. Assim, podemos facilmente gerar um grande número de gut-tropical e não gut trópico de linfócitos ex vivo pela ativação de células T na presença ou ausência de RA, respectivamente, o que pode ser finalmente utilizado nos experimentos competitivos homing descrito aqui.

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Competitiva homing experimentos permitem avaliar diretamente as propriedades migratória de duas populações celulares diferentes em um único rato. Aqui nós ilustrar este procedimento através da comparação da migração de ex-vivo gerado gut trópico-versus non-gut células T trópico.

Competitiva Ensaios Homing para Estudar Gut trópico-Migração de Células T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Imunologia e Infecção

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Uma avaliação quantitativa da migração celular pelo ensaio Phagokinetic faixa Motilidade

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

O transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células T CD4 alogênico em camundongos

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Um ensaio baseado em CFSE para estudar a migração de Murino pele as células dendríticas em drenagem gânglios linfáticos durante a infecção com<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Usando cristalografia de raios X, Biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula T mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de Câncer Antígenos

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...