Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

EJV поддерживается стипендий, начиная с Крона и колит фонда Америки (CCFA). JRM поддерживается грантами CCFA, Рак-исследовательский институт (CRI), Говард Х. Гудман (MGH), штат Массачусетс Life Science Center (MLSC) и Нью-премии Новатор NIH директора с.

1. Ex естественных поколения кишки самонаведения и управления Т-клеток (см. рисунок 1) <ol><li> Изолировать от спленоцитов затирания один из селезенки мышей дикого типа. Ресуспендируют клетки суспензии в PBS и центрифуги для 5 &#39;при 400 х г. Удалить супернатант и лизировать эритроциты кров...

<ol>
	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

Хотя самонаведения эксперименты дают очень ценную информацию о миграции от общего числа клеточных популяций в той или иной ткани, следует иметь в виду, что эти тесты не непосредственно анализировать эндотелиальной адгезии и, следовательно, не являлись дискриминационными по какой эта?...

Животные: C57BL / 6 мышей обычно используются для изоляции Т-клеток. Кроме того, CD45.1 и Thy1.1 congenic штаммов доступны через Джексон Laboratories (Bar Harbor, ME). Культура СМИ: IMDM (Medium Искова изменения Дульбеко + L-глютамин + Hepes) плюс 10% тепла инактивированной FBS (эмбриональной телячьей сыворотки, низким эндотоксин, Gibco ®, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) с добавлением 100 ЕД / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина (Hyclone Антибиотики, Waltham, MA), 0,5 мг / мл Fungizone / амфотерицина В (Gibco) и 50 мм б-меркаптоэтанола. ACK эритроцитов Лизис буфер (РБК, 10 мМ KHCO 3, 150 мМ NH 4 Cl, 0,1 мМ ЭДТА, рН 8,0), настроить до рН 7,2-7,4 и хранят при комнатной температуре). PBS (фосфатно-солевым буфером, Hyclone, Waltham, MA). Проточная цитометрия (FACS) СМИ (PBS или IMDM + 2% ЭТС + 5 мМ ЭДТА). При окрашивании использованием селектина-Fc химеры, средств массовой информации с 2 мМ Ca + + должен быть использован на всех этапах (в том числе приобретение FACS). IMDM рекомендуется в данном случае. Т маркировки клеток и приемных перевода: CFSE (карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил эфир), CMTMR ((5 - (а-6 )-((( 4-хлорметил) бензоил) амино) tetramethylrhodamine) из молекулярных проб ®, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния ). 1000 х запасы должны быть сделаны в ДМСО (5 мМ CFSE, 20 мМ CMTMR) и хранили при температуре -20 ° C. Поликлональные Т-клеточной активации: 24-и или 96-луночных планшетах (ткань-культура рассматривается, полистирол, с плоским дном с крышкой, BD Falcon, Франклин озер, NJ) инкубируют в течение 2 часов при 37 ° С с 50 мл PBS, соответственно , содержащие анти-CD3 плюс анти-CD28 антител (10 мг / мл каждая). Затем, культуры пластины дважды промывают PBS и использовать сразу по культуре Т-клеток. Кроме того, Dynabeads покрытые anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) может быть использован для активации Т-клеток, а не пластины-связанных антител. Проточная цитометрия (FACS) окрашивания: Поликлональные активации: CD3 (1452C11), CD28 (37,51). Lineage мАт: CD4 (L3T4), CD8a (Ли-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-самонаведения рецепторов: очищенная CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, Сан-Диего, Калифорния), a4b7 (LPAM-1/DATK3), изотипа контроля (IgG2a, к). Кожа самонаведения рецепторов: P-селектина-Fc (очищенная Мышь P-селектина - IgG гибридный белок, BD Pharmingen, Сан-Хосе, Калифорния), Е-селектина-Fc (рекомбинантный E-Selectin/Fc Мышь Химера, R &amp; D Systems, Minneapolis, М. Н.), а также соответствующего вторичного F козу реагента (аЬ &#39;) 2 анти-человеческий IgG R-PE (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). All-транс-ретиноевой кислоты (Sigma, Сент-Луис, Миссури) ресуспендируют в абсолютном этаноле или ДМСО использованием желтой лампы или косвенным источником света во время подготовки. Магазин аликвоты в стеклянных флаконах при температуре -80 ° С в защищенном от света во все времена. Синтетические RAR-агонисты: Am80 (Вако химических веществ, Richmond, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

Для того, чтобы осуществлять свои функции лимфоцитов нужно выходить из крови и мигрировать в различные ткани в организме. Лимфоцитов адгезией к эндотелиальных клеток и тканей экстравазации это многоэтапный процесс контролируется различных молекул адгезии (самонаведения рецепторы), выраженные на лимфоциты и их лигандами (addressins), представленные на эндотелиальные клетки 1 2. Хотя функция этих рецепторов адгезии может быть частично изучен бывших естественных условиях, конечным критерием для их физиологическое значение заключается в оценке их роли в процессе в естественных лимфоцитов адгезии и миграции. Два дополнительных стратегии были использованы для этой цели: прижизненной микроскопии (IVM) и самонаводящиеся экспериментов. Хотя IVM было важно определить точный вклад специфические рецепторы адгезии во время адгезии каскада в режиме реального времени и в различных тканях, IVM это много времени и трудоемкий, он часто требует разработки сложных хирургических методов, необходимо предварительное выделение однородных клеточных популяций и позволяет анализ только одной ткани / органа в любой момент времени. В отличие от конкурентных самонаведения экспериментов позволяют прямой и одновременного сравнения в миграции из двух (или даже больше) ячейки подмножеств в той же мыши, и они также позволяют анализа многих тканей и большое количество клеток в одном эксперименте. Здесь мы опишем классической конкурентной самонаведения протокол, используемый для определения преимуществ / недостатков данного типа клеток на главную конкретных тканей по сравнению с популяцией клеток контроля. Мы выбрали для иллюстрации миграционных свойств кишки по сравнению с тропическими без кишки тропических Т-клеток, так как слизистая оболочка кишечника является крупнейшим поверхности тела в контакте с внешней средой, и это также экстра-лимфоидной ткани с лучшими определенные миграционные требования . Кроме того, недавние работы установили, что витамин метаболит полностью транс-ретиноевой кислоты (РА) является основной молекулярный механизм, ответственный за склонение кишки специфическую адгезию рецепторов (интегрин a4b7and хемокинов рецептор CCR9) на лимфоцитах. Таким образом, можно легко генерировать большое количество кишки тропических и не тропических кишки лимфоциты исключая виво путем активации Т-клеток в присутствии или отсутствии РА, соответственно, может быть, наконец, используемые в конкурентной самонаведения экспериментах, описанных здесь.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Конкурентные самонаведения эксперименты позволяют непосредственно оценки миграционных свойства двух различных клеточных популяций в одной мыши. Здесь мы проиллюстрируем эту процедуру путем сравнения миграции бывших естественных генерируемых кишки тропических против не-клетках кишечника тропических T.

Конкурентные Homing Анализы по изучению тропических Гут-Т-клеток миграции

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Человеческий Т-лимфоцитов изоляции, культуры и анализ миграции In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Неинвазивная Визуализация лейкоцитов самонаведения и миграции В естественных условиях</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Количественные оценки миграции клеток в Phagokinetic анализа подвижности трек

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Аденовирусной трансдукции наивного CD4 Т-клеток по изучению Treg Дифференциация

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Трансплантация кожи хвоста изучать Аллогенная лимфоцитов CD4 ответов у мышей

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Мышь наивного CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток Выделение и<em&gt; В пробирке</em&gt; Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Воображение CD4 Т-клеток Внутритканевая миграции в воспаленном дермы

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Пробирного CFSE основе для изучения миграции мышиной кожи дендритных клеток в Опорожнение лимфатических узлов во время инфекции с<em&gt; Mycobacterium Bovis</em&gt; Кальметта-Герена

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

С помощью рентгеновской кристаллографии, биофизики и функциональными пробами, чтобы определить механизмы управляющих Т-клеточного рецептора распознавания рака антигенам

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...