Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
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EJV es apoyado por una beca de la enfermedad de Crohn s &amp; Colitis Foundation of America (CCFA). JRM es apoyado por becas de CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) y Premio a la Innovación Nuevo director del NIH, s.

1. Ex generación in vivo de células T del intestino-homing y control (ver Figura 1) <ol><li> Aislar esplenocitos por maceración un bazo de ratones de tipo salvaje. Resuspender la suspensión de las células en PBS y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Eliminar el sobrenadante y lisar los glóbulos rojos por la resuspensión del sedimento de células en 4 ml de solución amortiguadora de lisis ACK durante 2-3 minutos. Después de eso, añadir 5 ml de PBS. Centrifugar durante 5 &#39;a 400 xg y ...

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	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

A pesar de que los experimentos homing proporcionar información muy valiosa acerca de la migración de la población total de células en un tejido determinado, se debe tener en cuenta que estos ensayos no analizan directamente de adhesión endoteliales y por lo tanto no discriminar en qué etapa (s) de la adhesión de varios pasos cascada (tethering / móvil, activación o pegue) un determinado receptor homing está actuando. El estándar de oro para definir el papel específico de los receptores de homing en la casca...

Animales: ratones C57BL / 6 se utilizan para el aislamiento de células T. Además, CD45.1 y Thy1.1 cepas congenic están disponibles a través Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Los medios de cultivo: IMDM (medio modificado de Iscove Dulbecco + L-Glutamina + Hepes) más el 10% SFB inactivado por calor (bovino fetal endotoxina en suero, baja, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA), complementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina (antibióticos HyClone, Waltham, MA), 0,5 mg / ml fungizone / anfotericina B (Gibco) y 50 mM b-mercaptoetanol. ACK Glóbulos Rojos tampón de lisis (RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), ajustar el pH a 7,2-7,4 y almacenar a temperatura ambiente). PBS (tampón fosfato salino, Hyclone, Waltham, MA). La citometría de flujo (FACS) los medios de comunicación (PBS o IMDM + 2% de SFB + 5 mM EDTA). Cuando la tinción con Selectina-Fc quimeras, los medios de comunicación con 2 mM de Ca + + se debe utilizar en todos los pasos (incluyendo la adquisición de FACS). IMDM se recomienda en este caso. T etiquetado celular y la transferencia adoptiva: CFSE (diacetato carboxifluoresceína, succinimidil éster), CMTMR ((5 - (y-6 )-((( 4-clorometil) benzoilo) amino) tetrametilrodamina) de Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1.000 acciones x debe hacerse en DMSO (5 CFSE mm, 20 mm CMTMR) y almacenados a -20 ° C. La activación policlonal de células T: 24 y 96 o bien placas (cultivo de tejidos tratados, de poliestireno, de fondo plano con tapa, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) se incuban durante 2 horas a 37 ° C con 50 ml de PBS, respectivamente , que contiene anti-CD3 además de los anticuerpos anti-CD28 (10 mg / ml cada uno). A continuación, las placas de cultivo se lavan dos veces con PBS y se utiliza inmediatamente para el cultivo de células T. Por otra parte, Dynabeads recubiertas con anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) se puede utilizar para la activación de células T en lugar de obligado placa de anticuerpos. Citometría de flujo (FACS) de tinción: la activación policlonal: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage MAB: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptores: purificada CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), control de isotipo (IgG2a, k). Homing la piel de los receptores: P-selectina-Fc (purificada ratón P-selectina - IgG proteína de fusión, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectina Fc (E-Selectin/Fc ratón recombinante quimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) más el correspondiente F secundario de cabra reactivo (ab &#39;) 2 anti-IgG humana R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). El ácido trans-retinoico (Sigma, St. Louis, MO) se vuelve a suspender en etanol absoluto o DMSO con una bombilla de color amarillo o una fuente indirecta de la luz durante la preparación. Alícuotas de almacenar en frascos de vidrio a -80 ° C y protegido de la luz en todo momento. RAR-agonistas sintéticos: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

Con el fin de ejercer su función de linfocitos necesidad de salir de la sangre y migran hacia los diferentes tejidos del cuerpo. La adhesión de linfocitos a las células endoteliales y la extravasación de tejido es un proceso de múltiples pasos controlados por diferentes moléculas de adhesión (receptores homing) expresa en los linfocitos y sus respectivos ligandos (addressins) que aparecen en las células endoteliales 1 2. A pesar de que la función de estos receptores de adhesión puede ser parcialmente estudiado ex vivo, la prueba definitiva de su relevancia fisiológica es para evaluar su función en vivo en la adhesión de linfocitos y la migración. Dos estrategias complementarias se han utilizado para este propósito: la microscopía intravital (IVM) y los experimentos mensajeras. A pesar de IVM ha sido esencial para definir la contribución exacta de los receptores de adhesión específicas en la cascada de adherencia en tiempo real y en diferentes tejidos, IVM es mucho tiempo y mano de obra intensiva, que a menudo requiere el desarrollo de sofisticadas técnicas quirúrgicas, es necesario el aislamiento previo de homogeneidad las poblaciones de células y permite el análisis de un solo tejido / órgano en un momento dado. Por el contrario, la competencia experimentos homing permitir la comparación directa y simultánea en la migración de los dos (o más) subconjuntos de células en el mismo ratón y también permiten el análisis de muchos tejidos y de un elevado número de células en el mismo experimento. A continuación se describe el protocolo de la competencia clásica mensajeras para determinar la ventaja / desventaja de un tipo de célula a la casa a tejidos específicos, en comparación con una población de células control. Hemos elegido para ilustrar las propiedades migratorias de la tripa-tropical frente a las células T no destripar-trópico, debido a que la mucosa intestinal es la mayor superficie del cuerpo en contacto con el medio externo y es también el tejido extra-linfoides con los requisitos de mejor definidos migratorias . Por otra parte, trabajos recientes han determinado que la vitamina A metabolito ácido trans-retinoico (RA) es el principal mecanismo molecular responsable de la inducción al intestino receptores específicos de la adhesión (integrinas receptor de quimiocinas a4b7and CCR9) en los linfocitos. Por lo tanto, fácilmente puede generar un gran número de intestino tropicales y no tropicales los linfocitos al intestino ex vivo mediante la activación de células T en la presencia o ausencia de RA, respectivamente, que pueden ser finalmente utilizado en los experimentos competitivos homing se describe aquí.

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Competitiva experimentos homing permiten la evaluación directa de las propiedades migratorias de dos poblaciones diferentes de células en un ratón. Aquí se ilustra este procedimiento mediante la comparación de la migración de los ex vivo generado intestino tropicales versus no-gut células T trópico.

Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Investigación

Inmunología e Infección

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Una evaluación cuantitativa de la migración celular mediante el ensayo de la canción Motilidad Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

La transducción adenoviral de células T CD4 + naïve a estudiar la diferenciación Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

El trasplante de la cola de la piel para el Estudio alogénico de células T CD4 respuestas en ratones

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Un ensayo basado en CFSE para estudiar la migración de la piel murina de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje durante la infección con<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

El uso de cristalografía de rayos X, Biofísica y Ensayos funcionales para determinar la célula T mecanismos que rigen el reconocimiento del receptor de antígenos del cáncer

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...