Name: competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

EJV stöds av ett stipendium från Crohns &amp; kolit Foundation of America (CCFA). JRM stöds med bidrag från CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) och NIH Director är nytt Innovator Award.

1. Ex vivo-generationen tarm-homing och kontroll T-celler (se figur 1) <ol><li> Isolera splenocytes genom att mosa en mjälte från vildtyp möss. Resuspendera cellerna fjädring i PBS och centrifugera i 5 &quot;vid 400 x g. Avlägsna supernatanten och lyseras de röda blodkropparna genom resuspending cellpelleten i 4 ml ACK lyseringsbuffert i 2-3 minuter. Efter det, tillsätt 5 ml PBS. Centrifugera i 5 &quot;vid 400 xgi och avlägsna supernatanten. </li><li> Resuspendera totalt splenocytes på 1 x 10 6<...

<ol>
	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

Även om målsökande experiment ger mycket värdefull information om migration av totala cellpopulationer i en viss vävnad, bör man hålla i minnet att dessa analyser inte direkt analysera endotelceller vidhäftning och därför inte diskriminera på vilket steg (s) i flera steg vidhäftning kaskad (tethering / löpande, aktivering eller sticker) ett givet homing receptor agerar. Guldmyntfoten att definiera den särskilda roll som homing receptorer i vidhäftning Cascade är intravital mikroskopi (IVM) i vilka enskil...

Djur: C57BL / 6 möss används ofta för T-cell isolering. Dessutom CD45.1 och Thy1.1 congenic stammar är tillgängliga via Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Kultur medier: IMDM (Iscove ändrade Dulbecco på medellång + L-glutamin + Hepes) plus 10% värmeinaktiveras FBS (fetalt bovinserum, låg endotoxin, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA) kompletterat med 100 E / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin (HyClone Antibiotika, Waltham, MA), 0,5 mg / ml fungizone / amfotericin B (Gibco) och 50 mm B-merkaptoetanol. ACK röda blodkroppar lyseringsbuffert (RBC, 10 mm KHCO 3, 150 mm NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), justera till pH 7,2-7,4 och förvara i rumstemperatur). PBS (Fosfatbuffrad saltlösning, Hyclone, Waltham, MA). Flödescytometri (FACS) media (PBS eller IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). Vid färgning med selektin-Fc chimärer, media med 2 mm Ca + + bör användas i alla steg (inklusive FACS förvärv). IMDM rekommenderas i detta fall. T-cell märkning och adoptiv transfer: CFSE (carboxyfluorescein diacetat, succinimidyl ester), CMTMR ((5 - (och-6 )-((( 4-klormetyl) benzoyl) amino) tetramethylrhodamine) från molekylära sonder ®, Invitrogen, Karlsbad, Kalifornien ). 1000 x bestånd bör göras i DMSO (5 mm CFSE, 20 mm CMTMR) och förvaras vid -20 ° C. Polyklonala T cells aktivering: 24-bra eller plattor med 96 brunnar (vävnads-kultur behandlas, polystyren, flat botten med lock, BD Falcon, Franklin Lakes, New Jersey) inkuberas i två timmar vid 37 ° C med 50 ml PBS, respektive , som innehåller anti-CD3 plus anti-CD28 antikroppar (10 mg / ml vardera). Sedan är odlingsplattor tvättas två gånger med PBS och användas omedelbart för T cellkultur. Alternativt kan Dynabeads belagda med anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) användas för T-cell aktivering i stället för plåt-bundna antikroppar. Flödescytometri (FACS) färgning: Polyklonala aktivering: CD3 (1452C11), CD28 (37,51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptorer: renat CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotypisk kontroll (IgG2a, k). Hud-homing receptorer: P-selektin-Fc (Renad mus P-selektin - IgG fusionsprotein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selektin-Fc (rekombinant mus E-Selectin/Fc Chimera, FoU-system, Minneapolis, MN) plus motsvarande sekundära reagens get F (ab &#39;) 2 anti-humant IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). All-trans retinoinsyra (Sigma, St Louis, MO) är suspenderade i absolut etanol eller DMSO med en gul glödlampa eller en indirekt ljuskälla under förberedelserna. Förvara alikvoter i glasflaskor vid -80 ° C och skyddas från ljus i alla lägen. Syntetiska RAR-agonister: Am80 (Wako Kemikalier, Richmond, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

För att utöva sin funktion lymfocyter behov av att lämna blod och migrera till olika vävnader i kroppen. Lymfocyter vidhäftning till endotelceller och vävnad extravasering är en flerstegsprocess som styrs av olika adhesionsmolekyler (målsökande receptorer) uttryckt på lymfocyter och deras respektive ligander (addressins) som visas på endotelceller 1 2. Även om funktionen hos dessa vidhäftning receptorer delvis kan studeras ex vivo, det ultimata testet för deras fysiologiska betydelse är att bedöma deras roll under in vivo-lymfocyter vidhäftning och migration. Två kompletterande strategier har använts för detta ändamål: intravital mikroskopi (IVM) och homing experiment. Även IVM har varit nödvändigt att definiera den exakta bidrag från särskilda vidhäftning receptorer under vidhäftning kaskaden i realtid och i olika vävnader, är IVM tidskrävande och arbetsintensiv, det ofta kräver utveckling av avancerade kirurgiska tekniker, behöver den innan isolering av homogena cellpopulationer och den tillåter analys av endast en vävnad / organ vid varje given tidpunkt. Däremot konkurrenskraftiga målsökande experiment möjligt att direkt och samtidig jämförelse i migreringen av två (eller fler) cell delmängder i samma mus och även tillåter analys av många vävnader och av ett stort antal celler i samma experiment. Här beskriver vi den klassiska konkurrenskraftiga målsökande protokoll som används för att bestämma fördel / nackdel för en viss celltyp till hem till specifika vävnader jämfört med en kontrollgrupp cellpopulation. Vi valde att illustrera flyttande egenskaper gut-tropism kontra icke gut-tropism T-celler, eftersom tarmslemhinnan är den största kroppsyta i kontakt med den yttre miljön och det är också den extra lymfvävnad med de bästa definierade flyttande krav . Dessutom har senaste arbete fastställt att vitamin A metabolit all-trans retinoinsyra (RA) är den viktigaste molekylära mekanism som ansvarar för att framkalla gut-specifik vidhäftning receptorer (integrin a4b7and kemokinreceptorn CCR9) på lymfocyter. Därmed kan vi skapa lätt ett stort antal tarm-tropism och icke tarm-tropism lymfocyter ex vivo genom att aktivera T-celler i närvaro eller frånvaro av RA, respektive, som slutligen kan användas i den konkurrensutsatta målsökande experiment som beskrivs här.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Konkurrenskraftiga målsökande experiment gör det möjligt att direkt bedöma flyttande egenskaper av två olika cellpopulationer i en enda mus. Här har vi illustrerar detta förfarande genom att jämföra migration av ex vivo-genererade gut-tropism kontra icke-gut tropic celler T.

Konkurrenskraftiga Homing Analyser för att studien Gut-tropism T cell migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Humana T-lymfocyter Isolering, Kultur och analys av migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Icke-invasiv avbildning av Leukocyt Homing och migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

En kvantitativ utvärdering av cellmigration genom Phagokinetic Track Motility analys

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenoviral Transduktion av naiva CD4 T-celler för att studera Treg Differentiering

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation av Tail Hud att Studera Allogen CD4 T-cellsvar hos möss

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naiv CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering i T cellundergrupper

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Imaging CD4 T-cell Interstitial Migration i Inflammerade Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

En CFSE-baserad analys för att studera migration av dendritiska Murin hudceller i dränerande lymfkörtlar under infektion med<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guerin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Med användning av röntgenkristallografi, Biophysics, och Funktionella analyser för att bestämma de mekanismer som styr T-cellsreceptorigenkänning of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...