Name: detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using in situ pla, a proximity ligation assay
Uploaded: 2011-03-03T17:03:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay at JoVE.com

इस शोध MRC और बीबीएसआरसी अनुदान द्वारा वित्त पोषित है. हम Ulf है Landegren लैब में Agata Zieba और Katerina Pardalis धन्यवाद, तकनीक और उपयोगी सलाह की स्थापना के साथ मदद करने के लिए अपसला विश्वविद्यालय है. तकनीकी मदद और प्रस्तुति के लिए Olink Biosience.

1. कक्ष के चढ़ाना और बीएमपी के साथ उपचार <ol><li> संस्कृति GMEM Neuro2a कोशिकाओं में 10% FBS के साथ पूरक, 1x गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAM), 1x सोडियम पाइरूवेट और एल glutamine 1x. 16 अच्छी तरह से एक कक्ष स्लाइड में (0.05-% EDTA) trypsin और प्लेट अच्छी तरह से प्रति 15.000-20.000 कोशिकाओं का उपयोग कोशिकाओं भाजित. संस्कृति HEK293T या DMEM में Cos7 कोशिकाओं के 10% FBS, एल glutamine 1x और 1x पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है. उन्हें 70% इथेनॉल में डुबो और Immedge कलम 1 सेमी 2 कुओं आकर्षित का उपयोग करके polysine स्लाइड्स जीवाणुरहित . भाजित में 50 μl मध्यम (0.05-% EDTA) trypsin और प्लेट अच्छी तरह से प्रति 20.000-25.000 कोशिकाओं का उपयोग कोशिकाओं. </li><li> 37 में कोशिकाओं सेते ° humidified, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में सी. </li><li> 24 के बाद ज Neuro2a के लिए सीरम मुक्त GMEM (0.1 albumin%, 1x NEAM, 1x सोडियम पाइरूवेट और 1x एल glutamine के साथ पूरक) के साथ मध्यम या HEK293T के लिए सीरम मुक्त DMEM (एल Glutamine और 1x पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन साथ पूरक) के साथ की जगह Cos7 / और एच. 2-3 कोशिकाओं के लिए सेते सामान्य संवर्धन की शर्तों के तहत कोशिकाओं (यानी 10% FBS) के नियंत्रण के रूप में उपयोग के साथ तीन कुओं रखें. </li><li> वांछित समय के लिए dorsomorphin (बीएमपी मार्ग, 2 सुक्ष्ममापी अवरोध करनेवाला) या BMP4 (25 एनजी / एमएल) के साथ कोशिकाओं (10 मिनट 1 घंटे के लिए जैसे) 5 समझो . </li></ol> 2. फिक्सेशन और Permeabilization <ol><li> लगानेवाला, 4% पीएफए ​​तैयार. पीएफए ​​के 4 ग्राम वजन के 100 मिलीलीटर पीबीएस में एक 4% समाधान तैयार करने के लिए. 50 पर समाधान गर्म ° सी जब तक यह स्पष्ट है. 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर और 4 बजे दुकान ° सी के माध्यम से उपयोग करें जब तक समाधान फ़िल्टर करें. ताजा लगानेवाला (अधिक से अधिक 2 दिनों के लिए संग्रहीत नहीं) का उपयोग करें. </li><li> कुओं से मध्यम Aspirate और 1xPBS से धो. कोशिकाओं पर सीधे समाधान विंदुक के रूप में इस कक्षों की टुकड़ी में परिणाम कर सकते हैं मत करो. अगले कदम के लिए जाने से पहले, अगर चैम्बर स्लाइड्स का इस्तेमाल कर रहे हैं कक्षों निकालने के लिए, लेकिन कुओं के आसपास सिलिकॉन छोड़. </li><li> 10min के लिए 50 μl 4% पीएफए ​​और सेते आरटी पर आंदोलन के बिना, जोड़ें. </li><li> आरटी पर आंदोलन के साथ 3 एक्स 5 एक Coplin जार में मिनट के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें. </li><li> 0,5% पीबीएस में ट्राइटन एक्स 10 मिनट के लिए 100 आरटी पर आंदोलन के बिना के साथ कोशिकाओं को समझो. </li><li> आरटी पर आंदोलन के साथ 3 एक्स 5 एक Coplin जार में मिनट के लिए 0,05% टीबीएस में 20 बीच (टीबीएस-टी) के साथ कोशिकाओं धो. </li></ol> 3. अवरुद्ध <ol><li> बंद टीबीएस टी ठोकर. अच्छी तरह से प्रति Duolink द्वितीय अवरुद्ध समाधान (1x) की एक बूंद जोड़ें. </li><li> 1 ज के लिए 37 पर एक पूर्व गर्म आर्द्रता चैम्बर डिग्री सेल्सियस में स्लाइड्स सेते </li></ol> 4. प्राथमिक एंटीबॉडी <ol><li> मिक्स और 1:100 पर aP-Smad1/5/8 (खरगोश पॉलीक्लोनल) पतला और 1:100 पर (माउस मोनोक्लोनल) Duolink द्वितीय एंटीबॉडी मंदक (1x) में एक Smad4. AP-Smad1/5/8 भी तैयार है और एक ही नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सांद्रता में एक Smad4 अकेले. </li><li> स्लाइड्स से अवरुद्ध समाधान ठोकर. जितना संभव हो उतना अवरुद्ध समाधान निकालें, लेकिन अतिरिक्त ख्याल रखना एंटीबॉडी जोड़ने से पहले नहीं होने कोशिकाओं सूखी. कुओं एंटीबॉडी के समाधान के 40 μl जोड़ें. एक में अच्छी तरह से एक अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण के रूप में केवल एंटीबॉडी मंदक जोड़ने. </li></ol> 5. पीएलए जांच <ol><li> दो पीएलए (Duolink द्वितीय विरोधी माउस माइनस और Duolink PLUS विरोधी खरगोश द्वितीय) एंटीबॉडी मंदक में जांच 01:05 पतला. </li><li> स्लाइड्स से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान ठोकर. स्लाइड 1x Duolink द्वितीय धो बफर के साथ 2 बार 5 मिनट धो प्रत्येक आरटी पर आंदोलन के साथ एक Coplin जार में एक. </li><li> बंद स्लाइड से एक धो बफर ठोकर और पीएलए जांच समाधान जोड़ने के लिए (40 μl / अच्छी तरह से). 1 ज के लिए 37 पर एक पूर्व गर्म आर्द्रता चैम्बर डिग्री सेल्सियस में स्लाइड्स सेते </li></ol> 6. Ligation <ol><li> द्वितीय भंवर Duolink Ligation शेयर (5x) और उच्च शुद्धता पानी और मिश्रण में 01:05 पतला. जब पानी की मात्रा की गणना, खाते में ले ligase की मात्रा है कि पहले कुओं के मिश्रण के अलावा सिर्फ 1:40 के अंतिम कमजोर पड़ने पर जोड़ा जाएगा. </li><li> स्लाइड से पीएलए जांच समाधान ठोकर. 1x धो बफर में एक Coplin जार में 2 बार के लिए एक प्रत्येक 5 मिनट आरटी पर आंदोलन के साथ स्लाइड्स धो लें. </li><li> एक ठंड ब्लॉक (-20 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग फ्रीजर से बाहर ligase ले लो. एक 1:40 कमजोर पड़ने और भंवर में Ligation समाधान (6.1 में तैयार) ligase जोड़ें. </li><li> बंद स्लाइड्स से धो बफर ठोकर और Ligation - ligase समाधान जोड़ने के प्रत्येक अच्छी तरह से (40 μl / अच्छी तरह से). 30 मिनट के लिए 37 पर एक पूर्व गर्म आर्द्रता चैम्बर डिग्री सेल्सियस में स्लाइड्स सेते </li></ol> 7. प्रवर्धन नोट: Light संवेदनशील अभिकर्मकों. स्लाइड्स को प्रकाश से सुरक्षित रखें. <ol><li> उच्च शुद्धता पानी और मिश्रण में Duolink द्वितीय प्रवर्धन (5x) स्टॉक 01:05 पतला. जब पानी की मात्रा की गणना खाते में पोलीमरेज़ की मात्रा है कि पहले मिश्रण वें के अलावा सिर्फ 1:80 के अंतिम कमजोर पड़ने पर जोड़ा जाएगा लेई कुओं. </li><li> स्लाइड से समाधान Ligation ligase ठोकर. 1x धो बफर में स्लाइड्स धो के साथ 2 बार के लिए एक 2 आरटी पर आंदोलन के साथ एक Coplin जार में प्रत्येक मिनट. </li><li> एक ठंड ब्लॉक (-20 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग फ्रीजर से बाहर पोलीमरेज़ ले लो. एक 1:80 कमजोर पड़ने और भंवर में प्रवर्धन समाधान (7.1 में तैयार) पोलीमरेज़ जोड़ें. </li><li> बंद स्लाइड्स से धो बफर ठोकर और प्रवर्धन - पोलीमरेज़ समाधान जोड़ने के प्रत्येक अच्छी तरह से (40 μl / अच्छी तरह से). 100 मिनट के लिए 37 पर एक पूर्व गर्म आर्द्रता चैम्बर डिग्री सेल्सियस में स्लाइड्स सेते </li></ol> 8. इमेजिंग के लिए तैयार नोट: Light संवेदनशील अभिकर्मकों. स्लाइड्स को प्रकाश से सुरक्षित रखें. <ol><li> स्लाइड्स से समाधान प्रवर्धन - पोलीमरेज़ ठोकर और 1x Duolink द्वितीय धो बफर बी में 2 बार प्रत्येक 10min के लिए आरटी पर आंदोलन के साथ एक Coplin जार में धो. </li><li> 0.1 x धो बफर बी में स्लाइड्स डुबकी </li><li> 16-अच्छी तरह से स्लाइड से सिलिकॉन पूरी तरह से निकालें. ~ Duolink द्वितीय 40μl जोड़ें DAPI साथ coverslip पर बढ़ते मध्यम और धीरे यह यह थोड़ा इतना है कि वहाँ कवर पर्ची के तहत कोई हवाई बुलबुले हैं दबाने के नमूने पर जगह. फिक्स और नेल पॉलिश का उपयोग कर स्लाइड पर coverslip सील. इमेजिंग के लिए आगे बढ़ने से पहले कम से कम 15min के लिए रुको. </li><li> एक confocal या प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ नमूने का विश्लेषण. डिजिटल छवियों को प्राप्त करते हैं. </li></ol> 9. मात्रा का ठहराव नोट: Light संवेदनशील अभिकर्मकों. स्लाइड्स को प्रकाश से सुरक्षित रखें. <ol><li> Duolink ImageTool प्रयोग करने के लिए छवियों पर गिनती के लिए संकेत संकेत स्तर की एक माप प्राप्त है. </li><li> माप की तुलना करें और एक ग्राफ बना. </li></ol> 10. प्रतिनिधि परिणाम सीटू पीएलए प्रयोग में एक से परिणाम के रूप में असतत फ्लोरोसेंट धब्बे से पता चलता है. संकेत का स्थान विशिष्ट अध्ययन प्रोटीन पर निर्भर करता है. <img alt="चित्रा 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" /> 1 BMP4 उत्तेजना के बाद Neuro2a कोशिकाओं पर सीटू पीएलए में चित्रा . कक्ष 2 सुक्ष्ममापी (बीएमपी मार्ग के अवरोध करनेवाला) dorsomorphin (ए) या 25 एनजी / एमएल BMP4 के साथ इलाज किया गया (बी) के लिए 60 मिनट या अनुपचारित छोड़ दिया (CE). P-Smad1/5/8 और Smad4 के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए एक और बी प्राथमिक एंटीबॉडी aP-Smad1/5/8 अकेले (सी) और एक Smad4 अकेले (डी) या प्राथमिक की चूक में सक्रिय परिसरों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया एंटीबॉडी (ई) नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. ब्लू: DAPI, लाल: पीएलए संकेत. चित्र एक Leica SP5 confocal खुर्दबीन के साथ प्राप्त किया गया. (एफ) पीएलए संकेतों Duolink ImageTool सॉफ्टवेयर के साथ गिना गया और सेल प्रति नाभिक में धब्बे की औसत संख्या ग्राफ में प्रस्तुत है. (G) Neuro2a कोशिकाओं अनुपचारित छोड़ दिया गया या Dorsomorphin (2 सुक्ष्ममापी) या 60 मिनट के लिए BMP4 (25 एनजी / एमएल) के साथ इलाज. lysed कोशिकाओं और प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ के अधीन थे और aP-Smad1/5/8 और एक - PCNA के साथ नियंत्रण लोड हो रहा है के रूप में immunoblotting विश्लेषण. (*) गैर विशिष्ट बैंड. ध्यान दें कि aP-Smad1/5/8 एंटीबॉडी 3 अलग प्रोटीन के बीच भेद नहीं कर सकते Smad4 के साथ परिसर में उपस्थित थे.

<ol>
	<li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. o. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction.">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li><li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses.">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism.">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li><li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun/AP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun/Fra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 .</li><li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia.">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li><li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor/retinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids.">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li></ol>

इस वीडियो लेख के उत्पादन OLINK द्वारा प्रायोजित किया गया था जो एक निकटता ligation परख प्रक्रिया में इस्तेमाल किया अभिकर्मक बनाता है.

बगल में प्रोटीन परिसरों के दृश्य संकेत जहां प्रोटीन बातचीत और प्रोटीन संशोधन का मतलब है कि कोशिकाओं उनकी सतह से नाभिक के लिए एक संकेत भेजने के लिए उपयोग कर रहे हैं में अध्ययन के लिए विशेष रूप से महान मांग में है. यह संभव नहीं किया गया करने के लिए कल्पना और immunofluorescence के साथ बगल में पहले दो अंतर्जात प्रोटीन के बीच परिसरों यों है. एंटीबॉडी के सह स्थानीयकरण कम संकल्प प्रदर्शन और सच बातचीत कल्पना नहीं किया जा सकता है. पीएलए एक नई तकनीक है कि शोधकर्ताओं ने महान सफलता 6, 7 के साथ विभिन्न प्रणालियों में प्रयोग शुरू कर दिया है. यहाँ, हम प्रदर्शन कैसे पीएलए का उपयोग करने के लिए ही नहीं बल्कि कल्पना करने के लिए यों Smad बीएमपी उत्तेजना के बहाव के समय पर सक्रिय effectors के बीच अंतर्जात परिसरों. हम अलग Neuro2a और वाणिज्यिक (अंजीर 1) प्राप्त करने के लिए विभिन्न प्रजातियों (माउस Smad4 और aP-Smad1/5/8 खरगोश) में उठाया एंटीबॉडी पर भरोसा सहित ऊतक संस्कृति कोशिकाओं का इस्तेमाल किया. इस विधि हमें की अनुमति दी है, पहली बार के लिए, बस समय पर बीएमपी effector परिसरों के सक्रियण phosphorylated Smad1/5/8 की उपस्थिति देखते हैं, जो सब नहीं Smad4 साथ सक्रिय परिसरों में लगे हुए हो सकता है और नहीं. हम संकेतों (अंजीर 1F) और एक ही 8 कोशिकाओं (आंकड़ा 1G) के immunoblot से प्राप्त की मात्रा का ठहराव के साथ माप की तुलना में गिना. हम निष्कर्ष निकाला है कि स्पॉट की संख्या समय के साथ संकेत स्तर के एक सटीक माप तुलनात्मक प्रदान. तकनीक भी समान परिणामों के साथ अन्य सेल (HEK293T और Cos7) लाइनें (नहीं दिखाया डेटा है) पर लागू किया गया था. प्रौद्योगिकी के सिद्धांत के दो अद्वितीय Duolink किट के साथ प्रदान की जांच पर आधारित है. प्रत्येक पीएलए जांच एक अद्वितीय सिंथेटिक oligonucleotide है, जो एक पत्रकार के रूप में कार्य करता से जुड़ी एक माध्यमिक एंटीबॉडी के होते हैं. जांच की निकटता सटीक स्थान जहां इन जांच निकटता में जुड़े होते हैं पर डीएनए ligation की अनुमति देता है. oligonucleotides की दूरी है, जो की अनुमति देता है डीएनए संकरण और ligation (&lt;40nm) छोटे और इसलिए है, केवल प्रोटीन है कि बातचीत ligation अनुमति दे सकते हैं. ligated डीएनए और फिर परिलक्षित किया जा सकता है प्रवर्धित अनुक्रम का लेबल oligonucleotides के संकरण के साथ पता लगाया. प्रवर्धन विशिष्ट है के रूप में यह डीएनए डीएनए संकरण सिद्धांतों पर निर्भर करता है और भी उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है ligated डीएनए के रूप में परिलक्षित होता है कई गुना प्रारंभिक ligation घटना की वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप. प्रवर्धित डीएनए लेबल oligonucleotides के साथ संकरण द्वारा पता लगाया है और एक दृश्य और नहीं बल्कि बड़ी जगह पैदा करता है. पीएलए संकेत के रूप में स्पॉट गिना जा सकता है, न ही सटीक स्थानिक जानकारी (बातचीत घटनाओं के स्थान) लेकिन इन घटनाओं 2-4 बढ़ाता की भी एक उद्देश्य तरीका प्रदान करता है. अन्य तकनीक है कि प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए नियोजित कर रहे हैं सह immunoprecipitation, immunofluoresence और प्रतिदीप्त प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) शामिल हैं. सह - immunoprecipitation assays के व्यापक रूप से प्रोटीन परिसरों के अलगाव को सक्षम करने के लिए उपयोग किया जाता है. विधि immunoblotting जिसका मतलब है कि प्रोटीन अपेक्षाकृत उच्च स्तर पर व्यक्त किया जाना चाहिए क्रम में करने के लिए पता लगाया जा के साथ है. उच्च पृष्ठभूमि या गैर विशिष्ट कुछ प्रोटीन के मोती के लिए बाध्य की समस्याएं कभी कभी सह immunoprecipitation पर काबू पाने के लिए मुश्किल है. इसके अलावा, सह immunoprecipitation assays प्रोटीन है कि एक प्रोटीन जटिल हिस्सा हो सकता है का पता लगाने की अनुमति है, लेकिन उन है कि बहुत करीब निकटता में एक दूसरे के साथ शारीरिक बातचीत कर रहे हैं भेद नहीं कर सकते. इसके अलावा, सह immunoprecipitations quantitation एकल कक्ष या कक्ष में प्रोटीन परिसरों का स्थानीयकरण पर संकल्प जानकारी में नहीं प्रदान कर सकते हैं. या immunofluoresence द्वारा एक सेल डिब्बे कक्ष में प्रोटीन परिसरों के सह - अस्तित्व की जांच विसरित संकेतों के ओवरलैप पर आधारित है और इसलिए, कम स्थानिक संकल्प किया है और प्रोटीन बातचीत पर सटीक जानकारी प्रदान नहीं कर सकते. Immunofluoresence संकेत की मात्रा का ठहराव दृश्य अनुमान द्वारा किया जा सकता है सिर्फ अगर अंतर कई गुना है, और सटीक या पीएलए धब्बे के रूप में औसत दर्जे का नहीं कर सकते. झल्लाहट जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन परिसरों के दृश्य की अनुमति देता है और एंटीबॉडी के लिए की जरूरत है और मिलान के जोखिम पर काबू है. झल्लाहट, हालांकि आम तौर पर कृत्रिम जुड़े प्रोटीन, जो पीएलए के रूप में अंतर्जात प्रोटीन परिसरों को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते की overexpression पर निर्भर करता है. पीएलए प्रोटोकॉल में अवरुद्ध शर्तों महत्वपूर्ण है के रूप में एंटीबॉडी एकत्रीकरण होते हैं और पृष्ठभूमि में वृद्धि हो सकती है. वैकल्पिक अवरुद्ध शर्तों एंटीबॉडी उत्पाद शीट में पाया जा सकता है है. प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी चूक के साथ क्या गलत हो गया हो सकता है पर उचित नियंत्रण में जानकारी प्रदान करते हैं और वे हमेशा शामिल किया जाना चाहिए. यह महत्वपूर्ण है अलग एंटीबॉडी कि कम से कम पृष्ठभूमि जब वे अकेले इस्तेमाल किया जाता है और सबसे अच्छा संकेत दे जब वे एक साथ कर रहे हैं स्क्रीन. सेल के निर्धारणरास महत्वपूर्ण है के रूप में ज्यादा फिक्सिंग प्रोटीन परिसरों और पूरी तरह से denature के लिए नीचा हो सकता है, जबकि अपर्याप्त निर्धारण प्रक्रिया के चरणों के दौरान प्रोटीन परिसरों के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यह 3% लगानेवाला की एकाग्रता को कम करके या निर्धारण समय सीमित द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. हालांकि, निर्धारण है कि क्या प्राथमिक एंटीबॉडी विकृत प्रोटीन या नहीं पहचान पर भी निर्भर करता है. के रूप में पीएलए तकनीक बहुत ही संवेदनशील है, विशेष देखभाल करने के लिए ऊष्मायन बार और सूक्ष्म विभिन्न नमूनों के बीच समान शर्तों को रखने की जरूरत है. नमूने के अंतिम चरण से पहले किसी भी मामले में सूखी नहीं छोड़ा जाना चाहिए. सुखाने नमूनों की वृद्धि हुई पृष्ठभूमि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. अवरुद्ध समाधान के पूरी तरह हटाने के भी आदेश में पृष्ठभूमि से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. धोने बफ़र्स हमेशा उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर लाया जा के रूप में कम तापमान एंजाइमी प्रतिक्रियाओं को धीमा कर देती है. आगे की समस्या निवारण के लिए किट के मैनुअल देखें. यह दाग पीएलए संकेत (जैसे DAPI, actin आदि) के उप सेलुलर स्थानीयकरण का पता लगाने का उपयोग करने के लिए उपयोगी है. यहाँ हम DAPI (बढ़ते माध्यम) का इस्तेमाल किया है नाभिक दाग. पीएलए immunofluorescence के एंटीबॉडी के साथ उपयोग करने के लिए सेल प्रकार या सेलुलर डिब्बे (यहाँ दिखाया नहीं) निर्धारित के साथ संगत है. सटीक मात्रा का ठहराव संकेतों और विशेष सॉफ्टवेयर के उपयोग (Duolink छवि उपकरण, Olink Biosience) की गणना के द्वारा किया जा सकता है. हम अंत में कैसे सीटू पीएलए में उपयोग करने के लिए, Duolink किट का उपयोग कर बीएमपी तय की कोशिकाओं में संकेत और अपने फायदे प्रस्तुत पता लगाने: उपयोग करने के लिए आसान है, बेहद संवेदनशील है, कोई पृष्ठभूमि नहीं है, और एक अद्वितीय सक्रिय बीएमपी यों बगल में संकेत करने की क्षमता दिखा दिया है. इस तकनीक को लागू करने के लिए विभिन्न प्रोटीन बातचीत का अध्ययन की सीमा और प्राथमिक एंटीबॉडी कि जांच के तहत प्रोटीन की पहचान की उपलब्धता और गुणवत्ता पर निर्भर करता है.

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>GMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21710025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21063029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutogenBioclear</td>
<td>7.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11149068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11360070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16-well chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>178599</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-pSmad1/5/8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-Smad4 (B8) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>sc-7966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dorsomorphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>171260-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant Mouse BMP-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>5020-BP-010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>H5151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Detection Reagents (Orange)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OLINK</td>
<td>92007-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92004-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92002-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Mounting Medium with DAPI</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82040-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Wash Buffers Fluorescence</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
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detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using in situ pla, a proximity ligation assay

BMPs विकास और जैविक प्रभाव की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए जिम्मेदार हैं. बीएमपी रिसेप्टर्स (phosphorylate) Smad1/5/8 effectors, जो तब Smad4 के साथ एक जटिल फार्म और जहां वे प्रतिलेखन कारक के रूप में कार्य करने के लिए बीएमपी विशिष्ट बहाव एक प्रभाव आरंभ नाभिक के लिए टसकाना सक्रिय करें. Phospho - Smad पेप्टाइड्स के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ पारंपरिक इम्युनो प्रतिदीप्ति तकनीकों प्रदर्शन कम संवेदनशीलता, उच्च पृष्ठभूमि और सकल मात्रा का ठहराव की पेशकश के रूप में वे एंटीबॉडी संकेत की तीव्रता पर विशेष रूप से भरोसा अगर यह फ्लोरोसेंट सहज है. इसके अलावा, phospho - Smads सभी Smad4 के साथ परिसर में नहीं हो सकता है और सक्रिय प्रतिलेखन में लगे हुए हो सकता है. पीएलए के बगल में एक उच्च विशिष्टता और 2-4 संवेदनशीलता के साथ प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए सक्षम तकनीक है. प्रोटीन के डीएनए किराए के प्रवर्धन के साथ इस नई प्रौद्योगिकी जोड़े एंटीबॉडी मान्यता. यह एक स्थानीय, मान्यता घटना की सही स्थिति का खुलासा स्थलों में से एक एक के रूप में असतत संकेत उत्पन्न करता है. संकेतों की संख्या और गिना जा सकता है एक माप उपलब्ध कराने तुलना. हम सीटू पीएलए में लागू किया, Duolink किट का उपयोग कर एंटीबॉडी का एक संयोजन है कि बीएमपी संकेत phospho-Smad1/5/8 effectors और Smad4 का पता लगाने की अनुमति देता है केवल जब इन परिसर में निकटता यानी, जो संकेत के साथ ही होता है में हैं के साथ, सक्रियण. यह पहली बार है, दृश्य और अंतर्जात बीएमपी की माप के उच्च और BMP4 उत्तेजना के तहत एक समय बेशक प्रयोग में विशिष्टता संवेदनशीलता के साथ संकेत के लिए अनुमति दी.

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Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

यहां हम बताते हैं कैसे उपयोग करने के लिए एंटीबॉडी का एक संयोजन के साथ निकटता Ligation परख (पीएलए), अस्थि Morphogenetic (बीएमपी) प्रोटीन तय की कोशिकाओं में संकेत कल्पना. इस तकनीक हमें effector परिसरों सक्रिय अंतर्जात बीएमपी के परमाणु संचय का पालन करें और BMP4 उत्तेजना के तहत समय पर अपने स्तर यों की अनुमति दी.

Effector परिसर BMP4 के डाउनस्ट्रीम संकेतन का उपयोग करने की जांच बगल में पीएलए, एक निकटता Ligation परख

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

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Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

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