Name: transcriptome analysis of single cells
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome Analysis of Single Cells at JoVE.com

Dank aan Kevin Miyashiro voor plating en onderhouden van celculturen, Dr Terri Schochet voor het leveren van celculturen voor de foto&#39;s opgenomen in dit document. Daarnaast dank aan Kevin Miyashiro, dr. Peter Buckley, en Tiina Pertiz voor input op de ARNA procedure. De financiering voor dit werk was van het National Institute on Aging, het National Institute on Mental Health en de Human Resources Fact Finder fondsen van het Gemenebest van Pennsylvania.

<ol>
	<li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury.">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li><li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+biology.">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li><li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1:+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity.">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li><li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology.">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li><li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis:+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders.">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li><li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+synthesis+in+situ:+methods+and+applications.">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li><li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li><li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration.">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-1000 &#38; P-97 Pipette Cookbook. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , 28-29 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Megascript kit. , 7-8 .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MEGAclear kit. , 4-5 .</li><li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells.">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li><li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis:+Implications+for+neuronal+functioning.">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li><li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype.">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li><li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis:+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+(PREXCEL-Q).">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li><li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li><li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy.">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li></ol>

Dr Eberwine is een uitvinder op de ARNA patent dat is in licentie gegeven aan LBS technologieën waarin Dr Eberwine is een aandeel-houder.

Opmerkingen en problemen oplossen <ul><li> U kunt willen nemen voor en na foto&#39;s waaruit blijkt dat de doelcel werd geïsoleerd en dat de resterende penumbra bleef onaangeroerd. </li><li> Als er te veel oplossing is het invoeren van de pipet zoals je bent oogsten, kunt u 3-weg Luer-Lock fittingen en de zuiger van de spuit om positieve druk in de slang vast te houden. Het gewenste volume zal variëren met de aard van de verwerking, maar tot en met 5 pi moet fijn zijn voor de meeste toepassingen. </li></ul> Algemene tips over moleculaire biologische technieken <ul><li> Vortex alle voorraad slangen en spinnen ze naar beneden voor het toevoegen aan een reactie. NOOIT vortex enzymen. </li><li> Meng grondig reacties voor het toevoegen van het enzym om ervoor te zorgen dat de buffer is op de juiste concentratie. </li><li> Houden enzym voorraden bij -20 ° C indien mogelijk met behulp van een stratacooler. Anders, verwijder vlak voor gebruik, blijven op het ijs, en terug te keren onmiddellijk tot -20 ° C. </li><li> Altijd mastermengsels bij het voorbereiden van meer dan een reactie op de pipetteren fouten te verminderen. Bereken het volume nodig is op basis van het aantal monsters en voeg 10-20%. </li><li> Bewaar RNA bij -80 ° C te vertragen degradatie. RNA is het meest stabiel is opgeslagen in de buffer te vertragen apurination van RNA dat zich voordoet in zure omstandigheden. </li></ul> Algemeen overzicht van de ARNA Procedure Figuur 4A illustreert de eerste ronde van de ARNA procedure. In het eerste onderdeel reactie, de poly-T gedeelte van de T7-oligo (dT) primer selecteert voor mRNA soorten (lange witte rechthoek) door te binden aan de polyA staarten. Sommige microRNA&#39;s zijn ook gepolyadenyleerde en worden gevangen genomen door deze procedure. Nog belangrijker is echter de meest voorkomende RNA in de cel, ribosomaal RNA&#39;s, niet. Dit oligo fungeert als een primer voor reverse transcriptaseremmers naar een complementaire streng van de cDNA (lange grijze rechthoek) te synthetiseren met behulp van de mRNA als een sjabloon. De T7 gedeelte van de T7-oligo (dT) primer voorzien van de T7 RNA polymerase promotor in frame met de volgorde antisense mRNA naar het startpunt. Dit is later in de in vitro transcriptie reactie gebruikt. Vervolgens het mRNA in het mRNA / DNA hybride gemaakt in de vorige stap is gedeeltelijk gehydrolyseerd door RNase H het creëren van RNA &quot;primers&quot; (kleine witte rechthoeken), vergelijkbaar met de Okazaki fragmenten die in achterblijvende streng DNA-synthese. DNA-polymerase I maakt gebruik van de RNA-fragmenten aan premier DNA-synthese met behulp van de DNA complementair aan het mRNA als een sjabloon. Wanneer het de volgende RNA fragment, zijn vijf bereikt &#39;naar 3&#39; nuclease activiteit verwijdert de ribonucleotiden en vervangt ze door desoxyribonucleotiden. DNA-ligase wordt toegevoegd aan alle strengen waarbij de vervanging van de leidende streng is niet compleet afbinden. T4 DNA-polymerase wordt toegevoegd in te vullen in de gebieden waar de RNA-fragmenten dienden als eerste primers voor DNA-polymerase I het creëren van een stompe dubbelstrengs cDNA dat vervolgens wordt gezuiverd voordat u de IVT reactie. In de IVT reactie, T7 RNA-polymerase bindt aan de T7 promoter opgenomen in het dubbelstrengs cDNA en synthetiseert antisense-RNA-moleculen (lange zwarte rechthoeken) met behulp van de sense streng als een sjabloon. Dit dient als de amplificatiestap waarin duizenden antisense-RNA-moleculen worden geproduceerd uit elk dubbelstrengs cDNA-molecuul (figuur 4A). De tweede ronde, zoals afgebeeld in figuur 4B, begint met een reverse transcriptie reactie die is iets anders dan die van de eerste ronde sinds de start RNA is antisense (massief zwart rechthoek) en mist de gepolyadenyleerde staart, dat was het doelwit van de T7-oligo (dT) primer in de eerste ronde. Daarom wordt deze reactie gevuld met random primers (kleine grijze rechthoeken) en het RNA vervolgens gedenatureerd. De tweede streng reactie wordt dan gevuld door de T7-oligo (dT) primer, die voor de poly-A sequentie bindt aan het 3 &#39;einde van de sense RNA aangemaakt in de voorgaande reverse transcriptie reactie. Een andere IVT reactie wordt uitgevoerd op dezelfde wijze als in de eerste ronde. Deze tweede ronde is meestal minstens een keer herhaald om drie rondes van de versterking halen uit een enkele cel. Toepassingen De technieken die we hebben in dit artikel kan worden vertaald in een groot aantal toepassingen. De single celisolatie protocol kan worden aangepast voor gebruik in acute plakjes. 14 Hoewel technisch meer uitdagende, dezelfde principes toe te passen in deze alternatieve voorbereiding. Bovendien, als de grootte van de pipet is licht aangepast, kunnen opnamen van de fysiologie van de cellen worden gemaakt voor de oogst waardoor een goed gecontroleerde onderzoek van de moleculaire mechanismen achter de fysiologische uitgangen. Een andere kleine wijziging is om processen te isoleren uit de cel soma. 15 Voor deze toepassing, verzamel cellichamen met een pipet en gaan dan terug met een frisse pipet en het verzamelen van 100-300 geïdentificeerd Dendrites of axonen per collectie buis. 16 Zodra cellen zijn geoogst, vergelijkingen van mRNA dichtheden en composities kunnen worden gemaakt tussen verschillende en zelfs binnen dezelfde cel populaties. Het opnemen van gebiotinyleerde-UTP in de derde ronde ARNA zorgt voor microarray analyse om deze relatieve abundanties mRNA te bepalen. De samenstelling van de originele mRNA bevolking kan ook worden bepaald na de ARNA procedure met behulp van de volgende generatie sequencing. De versterkte ARNA kan ook worden gebruikt om de cel fenotype conversie studies waarin een volledige set van mRNA&#39;s van het ene celtype worden getransfecteerd in een ander celtype in om de overgang van het fenotype van de laatste celtype te induceren in die van de voormalige bevestigen, een procedure ontwikkeld door het lab en bekend staat als TIPeR. 17 Deze studies zijn vooral handig voor het bestuderen van de ziekte van staten en cel fenotypes en dergelijke studies zijn momenteel aan de gang in het lab. RT-PCR of qPCR kunnen worden uitgevoerd op het versterkte materiaal om de expressie van cel-specifieke genen te bevestigen. Daarnaast kan evaluaties van de efficiëntie van de transfectie of transductie worden gemaakt in de enkele cel niveau. Voordelen en beperkingen Zoals vermeld in het abstracte, isolatie van enkele cellen voor analyse elimineert de gemiddelde effecten gezien met een analyse van heterogene celpopulaties. Deze gemiddelde effecten verkeerd mRNA abundanties binnen een enkele cel door meer dan-die overvloedig transcripties en het gemiddelde uit en het voorkomen van detectie van een groot aantal low-overvloed transcripten. Flowcytometrie kan worden gebruikt om individuele cellen te sorteren, maar deze methode vereist kennis van cel-specifieke markers en dure apparatuur. 18 Laser capture microdissectie zowel met UV-of IR-laser capture microdissectie-systemen zorgen voor een cel en zelfs subcellulaire vast te leggen, maar vereist cellen van belang voor worden gevestigd op het oppervlak van zeer dunne secties. 19 Net als bij flowcytometrie, laser capture microdissectie vraagt ​​ook dure apparatuur. Een van de grote voordelen van de elektrode op basis collectie techniek hierboven beschreven is dat waardevolle elektrofysiologische gegevens kunnen worden verkregen uit de cel van belang voor de oogst, waardoor functionele en transcriptoom analyse worden uitgevoerd op dezelfde cel. 20 Een nadeel van onze techniek is dat het vereist ervaring met micromanipulators. Onderzoekers bekend zijn met micromanipulators vindt deze techniek zeer intuïtief, maar mensen met geen ervaring zal moeten vertrouwd raken met de vereiste fijne bewegingen. Inherent zijn aan elke amplificatietechniek is de preferentiële versterking van een aantal transcripties gebaseerd op grootte en nucleotide samenstelling. 4,6,7 Polymerase Chain Reaction (PCR) gebaseerde technieken, zoals reverse-transcriptie polymerase chain reaction (RT-PCR) en snelle amplificatie van cDNA einden (RACE) resulteren in exponentiële amplificatie van transcripten, terwijl de ARNA versterking procedure resulteert in een lineaire versterking. Zo is een van de belangrijkste voordelen van de ARNA procedure ligt in het vermogen om beter de relatieve abundanties van mRNA transcripten te behouden door alleen lineair versterken eventuele fouten of vooroordelen die optreden in het proces van versterking, in tegenstelling tot exponentieel versterken zei fouten en vooroordelen. Het Arna procedure in combinatie met microarray analyse maakt voor de vergelijking van de mRNA dichtheden tussen de enkele cellen van gelijksoortige of verschillende morfologie, behandeld of onbehandeld. Bovendien kan versterkt materiaal worden ingediend voor de volgende generatie sequencing. 5,8 echter zorg moeten worden genomen in dergelijke analyses omdat in tegenstelling tot het gebruik van willekeurige primers voor de procedure, de oligo-dT primer hierboven beschreven procedure vooroordelen versterking van de 3 &#39;einden van mRNA en leidt doorgaans tot een lichte verkorting van de latere versterkt materiaal met elke ronde. Voorzichtigheid is geboden bij de analyse van microarray resultaten met standaard methoden zoals sommige valse afwezig gesprekken kunnen het gevolg zijn van iets ingekort versterkt materiaal. Daarnaast, terwijl sequencing resultaten ook daadwerkelijk de volledige 5 geven &#39;volgorde van de meeste van de oorspronkelijke mRNA, de 5&#39; kan sequenties van sommige mRNA worden gemist. Om deze redenen moet het aantal ronden van de aanvullingen worden beperkt.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Spiegelgas coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological</td>
<td>63-3029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nunc 35x10 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-90</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water for cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-724Q</td>
<td>For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>6407</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>354239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Boric acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B0252</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and glutamax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41090-101</td>
<td>For plating cells</td>
</tr>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horse serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C1768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095-098</td>
<td>For growing cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 serum-free supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimble Chase</td>
<td>34500 99</td>
<td>Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. </td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175</td>
<td>Any solution will work as long as the components won&#x2019;t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)</td>
</tr>
<tr>
<td>1ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309628</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gauge depends on the diameter of the pipettes</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>28-4065-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dt-T7 oligo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom</td>
<td>Midland Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Second strand buffer (5x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Y01129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supplied with second strand buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>E.coli DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100002324</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA polymerase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004926</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnase H</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18021-071</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Megascript T7 kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Random primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BMB</td>
<td>11034731001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>56575</td>
<td>in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT</td>
</tr>
<tr>
<td>MEGAclear Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>1908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28206</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004994</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnasin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N251B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AMIL1791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-87</td>
<td>Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipette Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>MP-S15A</td>
<td>Will vary with micromanipulator and pipette O.D.</td>
</tr>
<tr>
<td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>5067-1511</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transcriptome analysis of single cells

Veel gen-expressie analyse technieken baseren zich op materiaal geïsoleerd uit heterogene populaties van cellen van weefsels of cellen homogenaten in cultuur. 1,2,3 In het geval van de hersenen, regio&#39;s zoals de hippocampus een complex geheel van verschillende celtypen bevatten, elk met verschillende mRNA profielen. De mogelijkheid om enkele cellen oogst zorgt voor een meer diepgaand onderzoek naar de moleculaire verschillen tussen en binnen celpopulaties. We beschrijven een eenvoudige en snelle methode voor het oogsten van cellen voor verdere verwerking. Pipetten vaak gebruikt in elektrofysiologie worden gebruikt om te isoleren (met behulp van aspiratie) een cel van belang en gemakkelijk te storten in een eppendorfbuisje voor verdere verwerking met een aantal van de moleculair-biologische technieken. Ons protocol kan worden aangepast voor de oogst van de dendrieten van celkweek of zelfs individuele cellen van acute plakjes. We beschrijven ook de ARNA amplificatie methode als een belangrijke downstream toepassing van enkele cel isolaties. Deze methode werd eerder ontwikkeld door ons lab als een alternatief voor andere gen-expressie analyse technieken, zoals reverse-transcriptie of real-time polymerase chain reaction (PCR). 4,5,6,7,8 Deze techniek zorgt voor lineaire versterking van de gepolyadenyleerde RNA te beginnen met slechts femtograms van materiaal en dat resulteert in microgram hoeveelheden van antisense-RNA. De lineair versterkte materiaal zorgt voor een nauwkeuriger schatting dan PCR-exponentiële amplificatie van de relatieve overvloed van onderdelen van het transcriptoom van de geïsoleerde cel. De basis bestaat uit twee rondes van de amplificatie. In het kort, is een T7 RNA polymerase promoter website opgenomen in de dubbel-strengs cDNA gemaakt op basis van het mRNA transcripten. Een overnachting in vitro transcriptie (IVT) reactie wordt vervolgens uitgevoerd waarbij T7 RNA polymerase veel antisense transcripten produceert uit het dubbelstrengs cDNA. De tweede ronde herhaalt dit proces, maar met enkele technische verschillen, omdat het uitgangsmateriaal is antisense-RNA. Het is standaard om de tweede ronde te herhalen, wat resulteerde in drie rondes van versterking. Vaak wordt de derde ronde in vitro transcriptie reactie uitgevoerd met behulp van gebiotinyleerd nucleosidetrifosfaten, zodat het geproduceerde antisense-RNA kan worden gehybridiseerd en gedetecteerd op een microarray. 7,8

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome Analysis of Single Cells at JoVE.com

Transcriptome Analysis of Single Cells

In dit artikel beschrijven we een eenvoudige methode voor het verzamelen van enkele cellen van rat primaire neuronale culturen en de daaropvolgende transcriptoom analyse met behulp van ARNA versterking. Deze aanpak is generaliseerbaar naar een willekeurige cel type.

Transcriptoom Analyse van de individuele cellen

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential Photo-bleken om Single Schwann cellen afbakenen op de neuromusculaire junctie

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture Microdissection van Verrijkt populaties van neuronen of Single Neuronen voor de analyse van genexpressie na traumatisch hersenletsel

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Turen naar Brain polysomen met Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Single-cell RNA-Seq van gedefinieerde subsetjes van retinale Ganglion-cellen

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analyse van immuuncellen in één ischiadicus zenuwen en achterwortelganglia Ganglion uit een enkele muis met behulp van Stroom Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Analyse van Spliceosomale snRNA lokalisatie in menselijke HeLa cellen met behulp van micro Injection

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Een schaalbaar model om de effecten van blunt-force letsel bij volwassen zebravissen te bestuderen

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...