Name: transcriptome analysis of single cells
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00
Duration: 7 min 27 s
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Merci à Kevin Miyashiro pour le placage et le maintien des cultures de cellules, le Dr Terri Schochet pour fournir des cultures de cellules pour les photos incluses dans ce document. En outre, merci à Kevin Miyashiro, le Dr Peter Buckley, et Tiina Pertiz pour l&#39;entrée sur la procédure ARNa. Le financement de ce travail a été de l&#39;Institut national sur le vieillissement, l&#39;Institut national sur la santé mentale et les fonds des ressources humaines enquêteur du Commonwealth de Pennsylvanie.

<ol>
	<li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury.">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li><li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+biology.">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li><li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1:+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity.">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li><li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology.">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li><li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis:+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders.">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li><li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+synthesis+in+situ:+methods+and+applications.">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li><li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li><li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration.">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-1000 &#38; P-97 Pipette Cookbook. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , 28-29 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Megascript kit. , 7-8 .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MEGAclear kit. , 4-5 .</li><li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells.">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li><li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis:+Implications+for+neuronal+functioning.">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li><li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype.">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li><li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis:+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+(PREXCEL-Q).">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li><li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li><li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy.">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li></ol>

Dr Eberwine est un inventeur sur le brevet ARNa qui a été autorisée aux technologies de LBS dans lequel le Dr Eberwine est un actionnaire.

Notes et Dépannage <ul><li> Vous voudrez peut-être à prendre avant et après des images montrant que la cellule cible a été isolé et que la pénombre reste a été laissé intact. </li><li> Si trop de solution est d&#39;entrer la pipette que vous récoltez, vous pouvez utiliser 3 voies Luer-Lock et le piston de la seringue pour tenir la pression positive dans le tube. Le volume désiré varie avec le type de traitement, mais jusqu&#39;à 5 ul devrait être bon pour la plupart des applications. </li></ul> Conseils généraux sur les techniques de biologie moléculaire <ul><li> Vortex tous les tubes des stocks et les spin-down avant d&#39;ajouter à une réaction. JAMAIS enzymes vortex. </li><li> Bien mélanger avant d&#39;ajouter les réactions de l&#39;enzyme de s&#39;assurer que le tampon est à la concentration appropriée. </li><li> Maintenir les stocks d&#39;enzymes à -20 ° C, si possible en utilisant un stratacooler. Sinon, retirez juste avant utilisation, garder sur la glace, et revenir immédiatement à -20 ° C. </li><li> Toujours faire master mix lors de la préparation plus d&#39;une réaction de réduire les erreurs de pipetage. Calculer le volume nécessaire en fonction du nombre d&#39;échantillons et d&#39;ajouter 10-20%. </li><li> Magasin de l&#39;ARN à -80 ° C à retarder la dégradation. L&#39;ARN est plus stable stocké dans le tampon d&#39;apurination retardent d&#39;ARN qui se produit dans des conditions acides. </li></ul> Aperçu général de la procédure ARNa Figure 4A illustre le premier tour de la procédure ARNa. Dans la réaction du premier brin, la portion de poly-T de la T7-oligo (dT) primer sélectionne des espèces d&#39;ARNm (long rectangle blanc) en se liant à la queue polyA. Certains microARN sont également polyadénylé et sera capturé par cette procédure. Plus important, cependant, les ARN les plus abondants dans la cellule, les ARN ribosomal, ne sera pas. Cet oligo agit comme une amorce pour la transcriptase inverse pour synthétiser un brin complémentaire de l&#39;ADNc (rectangle gris de long) en utilisant l&#39;ARNm comme un modèle. La portion de la T7 T7-oligo (dT) primer intègre le promoteur T7 RNA polymérase en phase avec la séquence antisens de l&#39;ARNm de départ. Ceci est utilisé plus tard dans la réaction de transcription in vitro. Ensuite, l&#39;ARNm dans les hybrides ARNm / ADN créée à l&#39;étape précédente est partiellement hydrolysé par la RNAse H créant ARN &quot;amorces&quot; (petits rectangles blancs) semblables à des fragments d&#39;Okazaki créé dans la synthèse des brins d&#39;ADN à la traîne. ADN polymérase I utilise des fragments d&#39;ARN pour la synthèse d&#39;ADN premiers en utilisant l&#39;ADN complémentaire de l&#39;ARNm comme un modèle. Quand il atteint le fragment suivant l&#39;ARN, son extrémité 5 &#39;à 3&#39; activité nucléase supprime les ribonucléotides et les remplace par des désoxyribonucléotides. L&#39;ADN ligase est ajoutée à ligaturer les brins où le remplacement du brin leader n&#39;est pas complète. ADN polymérase T4 est ajouté pour combler dans les zones où des fragments d&#39;ARN servi comme amorces initiales pour l&#39;ADN polymérase I de créer une extrémité franche ADNc double brin qui est ensuite purifié avant d&#39;effectuer la réaction d&#39;IVT. Dans la réaction d&#39;IVT, T7 RNA polymérase se lie au promoteur T7 incorporée dans les molécules d&#39;ADNc double brin et synthétise l&#39;ARN antisens (longs rectangles noirs) en utilisant le brin sens comme un modèle. Cela sert l&#39;étape d&#39;amplification dans lequel des milliers de molécules d&#39;ARN antisens sont produites à partir de chaque molécule ADNc double brin (figure 4A). Le second tour, comme le montre la figure 4B, commence par une réaction de transcription inverse qui est légèrement différent de celui de la première ronde depuis les ARN antisens de départ est (solide rectangle noir) et n&#39;a pas la queue polyadénylée qui était ciblé par la T7-oligo (dT) amorce dans le premier tour. Par conséquent, cette réaction est amorcée avec des amorces aléatoires (petits rectangles gris) et la suite dénaturé ARN. La réaction du deuxième brin est alors amorcée par la T7-oligo (dT) primer, qui se lie à la séquence poly-A à l&#39;extrémité 3 &#39;de l&#39;ARN sens créé dans la réaction de transcription inverse précédent. Une autre réaction d&#39;IVT est effectuée de la même manière que dans le premier tour. Ce second tour est habituellement répétée au moins une fois à atteindre trois cycles d&#39;amplification d&#39;une seule cellule. Applications Les techniques que nous avons présenté dans cet article peuvent être traduits dans un grand nombre d&#39;applications. Le protocole seule cellule d&#39;isolement peut être modifié pour une utilisation dans des tranches aiguës. 14 Bien que techniquement plus difficile, les mêmes principes s&#39;appliquent dans cette préparation suppléant. De plus, si la taille de la pipette est légèrement ajustée, les enregistrements de la physiologie des cellules peut être faite avant la récolte permettant de mener une enquête bien contrôlée des mécanismes moléculaires à l&#39;origine des sorties physiologiques. Une autre légère modification est d&#39;isoler les processus du soma cellulaire. 15 Pour cette application, de recueillir les corps cellulaires avec une pipette et ensuite revenir avec une nouvelle pipette et recueillir 100-300 dendrit identifiées ou des axones par tube de collecte 16. Une fois que les cellules ont été récoltées, les comparaisons des abondances ARNm et compositions peuvent être faites entre différents et même au sein des populations même cellule. Incorporer biotinylé-UTP dans le ARNa troisième tour permet l&#39;analyse des microréseaux afin de déterminer ces abondances relatives d&#39;ARNm. La composition de la population d&#39;ARNm d&#39;origine peut aussi être déterminé après la procédure ARNa utilisant le séquençage de nouvelle génération. Le ARNa amplifié peut également être utilisée pour confirmer les études cellulaires phénotype de conversion dans laquelle un ensemble complet d&#39;ARNm d&#39;un type de cellules sont transfectées dans un type cellulaire différent afin d&#39;induire la transition du phénotype de type cellule dernier dans celui de l&#39;ancien, une procédure développée par le laboratoire et connu sous le nom TIPER. 17 Ces études sont particulièrement utiles pour étudier les états pathologiques et les phénotypes cellulaires et des études sont actuellement en cours dans le laboratoire. RT-PCR ou PCR quantitative peut être effectuée sur le matériel amplifié pour confirmer l&#39;expression de gènes spécifiques de la cellule. En outre, les évaluations de l&#39;efficacité de la transfection ou la transduction peut être faite au niveau de la cellule unique. Avantages et limites Comme indiqué dans l&#39;abstrait, l&#39;isolement de cellules uniques pour l&#39;analyse élimine les effets de la moyenne observée avec l&#39;analyse de populations cellulaires hétérogènes. Ces effets moyenne dénaturer l&#39;abondance d&#39;ARNm dans une cellule unique par une sur-représentation des transcriptions abondante et une moyenne de sortir et éviter la détection de nombreux pays à faible abondance de transcriptions. La cytométrie en flux peut être utilisé pour trier des cellules individuelles, mais cette méthode nécessite la connaissance de la cellule des marqueurs spécifiques et des équipements coûteux. 18 microdissection laser, soit avec des systèmes laser UV ou IR microdissection permettent de cellule unique et même capturer subcellulaire, mais nécessite des cellules d&#39;intérêt pour être situés à la surface des sections très minces. 19 Similaire à la cytométrie en flux, microdissection laser nécessite également un équipement coûteux. Un des principaux avantages de la technique de collecte électrode à base décrit ci-dessus est que de précieuses données électrophysiologiques peuvent être obtenus auprès de la cellule d&#39;intérêt avant la récolte, permettant une analyse fonctionnelle et du transcriptome à effectuer sur la même cellule. 20 Un inconvénient de notre technique est qu&#39;elle exige une expérience en utilisant micromanipulateurs. Les enquêteurs familiers avec micromanipulateurs trouverez cette technique très intuitive, cependant, les individus qui n&#39;ont aucune expérience de ce type devra se familiariser avec les mouvements fins requises. Inhérentes à toute technique d&#39;amplification est l&#39;amplification préférentielle de certaines transcriptions basée sur la taille et la composition des nucléotides. 4,6,7 réaction en chaîne par polymérase (PCR) des techniques basées telles que transcription inverse réaction en chaîne de la polymérase (RT-PCR) et amplification rapide de l&#39;ADNc extrémités (RACE) résulte de l&#39;amplification exponentielle de transcriptions, tandis que les résultats ARNa procédure d&#39;amplification de l&#39;amplification linéaire. Ainsi, l&#39;un des principaux avantages de la procédure ARNa réside dans sa capacité à mieux préserver l&#39;abondance relative des transcrits d&#39;ARNm par seulement linéairement amplifiant les erreurs ou les préjugés qui se produisent dans le processus d&#39;amplification exponentielle par rapport à l&#39;amplification dudit erreurs et de préjugés. La procédure ARNa couplée à l&#39;analyse des microréseaux permet la comparaison des abondances d&#39;ARNm entre les cellules simples de morphologie similaire ou différente, traitée ou non traitée. En outre, les produits d&#39;amplification peuvent être soumises pour le séquençage de nouvelle génération. 5,8 Cependant, des précautions doivent être prises dans de telles analyses, car, contrairement à l&#39;utilisation d&#39;amorces aléatoires pour la procédure, la procédure d&#39;oligo-dT amorcée décrit ci-dessus l&#39;amplification des préjugés de l&#39; extrémités 3 &#39;des ARNm et aboutit généralement à léger raccourcissement du matériel amplifié suite à chaque tour. Des précautions doivent être prises dans l&#39;analyse des résultats puce à ADN avec des méthodes standard comme certains faux appels absents peuvent découler de matériel amplifié légèrement raccourcie. En outre, les résultats tout en séquençage sera en effet fournir la pleine 5 &#39;la séquence de la plupart des ARNm d&#39;origine, les séquences 5&#39; de certains ARNm pourrait être manquée. Pour ces raisons, le nombre de tours d&#39;amplifications devrait être limité.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Spiegelgas coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological</td>
<td>63-3029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nunc 35x10 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-90</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water for cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-724Q</td>
<td>For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>6407</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>354239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Boric acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B0252</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and glutamax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41090-101</td>
<td>For plating cells</td>
</tr>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horse serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C1768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095-098</td>
<td>For growing cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 serum-free supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimble Chase</td>
<td>34500 99</td>
<td>Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. </td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175</td>
<td>Any solution will work as long as the components won&#x2019;t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)</td>
</tr>
<tr>
<td>1ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309628</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gauge depends on the diameter of the pipettes</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>28-4065-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dt-T7 oligo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom</td>
<td>Midland Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Second strand buffer (5x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Y01129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supplied with second strand buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>E.coli DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100002324</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA polymerase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004926</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnase H</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18021-071</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Megascript T7 kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Random primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BMB</td>
<td>11034731001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>56575</td>
<td>in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT</td>
</tr>
<tr>
<td>MEGAclear Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>1908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28206</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004994</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnasin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N251B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AMIL1791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-87</td>
<td>Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipette Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>MP-S15A</td>
<td>Will vary with micromanipulator and pipette O.D.</td>
</tr>
<tr>
<td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>5067-1511</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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transcriptome analysis of single cells

Beaucoup de techniques d&#39;analyse d&#39;expression génique fonder sur des documents isolés de populations hétérogènes de cellules à partir d&#39;homogénats de tissus ou cellules en culture. 1,2,3 Dans le cas du cerveau, des régions telles que l&#39;hippocampe contient un agencement complexe de différents types de cellules, chacune avec profils ARNm distincts. La capacité à récolter des cellules individuelles permet une enquête plus approfondie sur les différences moléculaires entre et au sein des populations de cellules. Nous décrivons une méthode simple et rapide pour la récolte de cellules pour un traitement ultérieur. Pipettes souvent utilisé en électrophysiologie sont utilisées pour isoler (par aspiration) une cellule d&#39;intérêt et idéalement de le déposer dans un tube Eppendorf pour un traitement ultérieur avec un certain nombre de techniques de biologie moléculaire. Notre protocole peut être modifié pour la récolte des dendrites partir de culture cellulaire ou même des cellules individuelles à partir de tranches aiguës. Nous décrivons également la méthode d&#39;amplification ARNa comme une application majeure aval des isolements seule cellule. Cette méthode a été développée précédemment par notre laboratoire comme une alternative aux autres techniques d&#39;analyse d&#39;expression génique tels que transcription inverse ou en temps réel la réaction en chaîne polymérase (PCR). 4,5,6,7,8 Cette technique permet l&#39;amplification linéaire de la ARN polyadénylé en commençant par femtogrammes seulement du matériel et résultant en des quantités microgramme d&#39;ARN antisens. Le matériel amplifié linéairement fournit une estimation plus précise que la PCR d&#39;amplification exponentielle de l&#39;abondance relative des composantes du transcriptome de la cellule isolée. La procédure de base se compose de deux cycles d&#39;amplification. En bref, un site T7 RNA polymérase promoteur est incorporé dans ADNc double brin créé à partir des transcrits d&#39;ARNm. Une nuit dans la transcription in vitro (IVT) de réaction est ensuite effectué dans laquelle T7 RNA polymérase produit de nombreux transcrits antisens de l&#39;ADNc double brin. Le second tour répète ce processus, mais avec quelques différences techniques puisque le matériau de départ est un ARN antisens. Il est standard de répéter le second tour, résultant en trois cycles d&#39;amplification. Souvent, la troisième ronde, en réaction de transcription in vitro est réalisée en utilisant nucléosidetriphosphates biotinylé de telle sorte que l&#39;ARN antisens produit peut être hybridée et détectée sur une puce à 7,8.

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Transcriptome Analysis of Single Cells

Dans cet article, nous décrivons une méthode simple pour la récolte des cellules isolées de rat cultures primaires de neurones et l&#39;analyse du transcriptome en utilisant une amplification ultérieure ARNa. Cette approche est généralisable à tout type de cellule.

L&#39;analyse du transcriptome des cellules isolées

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

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Imagerie des cellules vivantes des cellules sensorielles de précurseurs d&#39;organes en Intact Drosophile Les chrysalides

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Recherche

Neurosciences

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Séquentielle photo-blanchiment sur le tracé de cellules de Schwann simple à la jonction neuromusculaire

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

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Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Microdissection par capture laser de populations enrichies de neurones neurones isolés ou pour l&#39;analyse d&#39;expression génique après un traumatisme crânien

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering au cerveau polysomes avec Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

L&#39;ARN monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analyse des cellules immunitaires dans unique des nerfs sciatique et Ganglion de la racine dorsale d’une souris à l’aide de cytométrie en flux

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Analyse de la localisation spliceosomale snRNA dans les cellules humaines d'Hela utilisant la microinjection

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Un modèle évolutif pour étudier les effets des blessures contondantes chez le poisson-zèbre adulte

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...