Name: transcriptome analysis of single cells
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome Analysis of Single Cells at JoVE.com

תודה קווין Miyashiro עבור ציפוי ושמירה על תרביות תאים, ד&quot;ר טרי שוחט למתן בתרביות תאים עבור התמונות הכלולים במסמך זה. בנוסף, תודה קווין Miyashiro, ד&quot;ר פיטר באקלי, ו Tiina Pertiz עבור קלט על ההליך ארנה. מימון עבור עבודה זו היה מן המכון הלאומי להזדקנות, המכון הלאומי לבריאות הנפש ואת משאבי אנוש Finder עובדה כספים Commonwealth פנסילבניה.

<ol>
	<li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury.">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li><li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+biology.">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li><li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1:+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity.">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li><li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology.">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li><li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis:+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders.">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li><li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+synthesis+in+situ:+methods+and+applications.">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li><li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li><li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration.">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-1000 &#38; P-97 Pipette Cookbook. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , 28-29 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Megascript kit. , 7-8 .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MEGAclear kit. , 4-5 .</li><li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells.">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li><li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis:+Implications+for+neuronal+functioning.">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li><li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype.">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li><li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis:+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+(PREXCEL-Q).">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li><li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li><li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy.">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li></ol>

ד&quot;ר Eberwine הוא ממציא על הפטנט ארנה כי כבר ברישיון כדי טכנולוגיות LBS שבו ד&quot;ר Eberwine הוא בעל המניות.

הערות ופתרון בעיות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ לקחת לפני ואחרי תמונות מראה כי תא היעד היה מבודד וכי הילה הנותרים נותר ללא שינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הפתרון יותר מדי נכנסת פיפטה כפי שאתה קציר, אתה יכול להשתמש 3 דרך Luer-Lock אביזרי על הבוכנה של המזרק כדי להחזיק לחץ חיובי בצינור. הנפח הרצוי ישתנו עם סוג של עיבוד אבל עד 5 μl אמור להיות בסדר עבור רוב היישומים. </li></ul> טיפים כלליים על שיטות ביולוגיות מולקולריות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס כל צינורות מניות ספין אותם לפני הוספת התגובה. לעולם אנזימים מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב ביסודיות התגובות לפני הוספת האנזים על מנת להבטיח כי המאגר הינו בריכוז הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על מניות אנזים ב -20 ° C ואם אפשר באמצעות stratacooler. אחרת, להסיר מיד לפני השימוש, לשמור על הקרח, ולחזור מיד -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד לעשות מאסטר מתערבב בעת הכנת אחד או יותר התגובה כדי להפחית טעויות pipetting. חשב את נפח הנדרש מבוסס על מספר דוגמאות ולהוסיף 10-20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות RNA ב -80 ° C עד השפלה מפגר. RNA הוא היציב ביותר מאוחסנים חיץ apurination מפגר של רנ&quot;א מתרחשת בתנאים חומציים. </li></ul> תרשים כללי של נוהל ארנה איור 4A מדגים את הסיבוב הראשון של ההליך ארנה. בתגובה הגדיל הראשון, החלק poly-T של פריימר (DT) T7-אוליגו בוחר עבור מינים mRNA (מלבן לבן ארוך) באמצעות קשירה של זנבות פולה. רנ&quot;א חלקם polyadenylated גם יהיה שנתפסו על ידי הליך זה. וחשוב יותר, עם זאת, RNAs הנפוץ ביותר בתא, RNAs ריבוזומלי, לא. אוליגו זה משמש פריימר עבור transcriptase הפוכה לסנתז גדיל משלים של cDNA (מלבן אפור ארוך) באמצעות ה-mRNA כתבנית. החלק T7 של פריימר (DT) T7-אוליגו משלבת את האמרגן T7-RNA פולימראז בתוך מסגרת עם antisense את רצף ה-mRNA אל ההתחלה. זה משמש מאוחר יותר את התגובה במבחנה ב שעתוק. בשלב הבא, ה-mRNA ב היברידית mRNA / DNA שנוצר בשלב הקודם הוא הידרוליזה חלקית על ידי Rnase H ליצירת רנ&quot;א &quot;פריימרים&quot; (מלבנים לבנים קטנים) דומה שברי Okazaki נוצר גדיל DNA סינתזה מפגרת. פולימראז ה-DNA אני משתמשת שברי RNA סינתזה DNA הממשלה באמצעות DNA משלים mRNA כתבנית. כשזה מגיע קטע הבא RNA, שלה 5 &#39;ל 3&#39; פעילות nuclease מסיר את ribonucleotides ומחליף אותם עם deoxyribonucleotides. האנזים דנ&quot;א מתווסף ולקשור כל גדילי שם החלפת גדיל מוביל אינה שלמה. פולימראז ה-DNA T4 הוא הוסיף למלא את האזורים בהם שברי RNA שימש primers הראשוני פולימראז ה-DNA אני יוצר בוטה, הסתיים גדילי כפול cDNA כלומר מטוהרים אז לפני ביצוע התגובה IVT. בתגובה IVT, T7-RNA פולימראז נקשר האמרגן T7 שולבו הכפול תקועים cDNA ו מסנתז antisense מולקולות RNA (מלבנים שחור ארוך) באמצעות גדיל תחושה כתבנית. זה משמש כצעד הגברה שבו אלפי מולקולות RNA antisense מיוצרים מולקולה כפולה כל cDNA תקועים (איור 4 א). הסיבוב השני, כמתואר באיור 4 ב &#39;, מתחיל עם תגובה שעתוק לאחור כי שונה במקצת מזו של הסיבוב הראשון מאז RNA המוצא היא antisense (מלבן שחור מוצק) וחסר הזנב polyadenylated כי היה ממוקד על ידי T7-אוליגו (DT) תחל בסיבוב הראשון. לכן, התגובה הזו היא ערוכה עם primers אקראית (קטן מלבנים אפורים) ו-RNA מפוגל לאחר מכן. התגובה גדיל השני הוא דרוך מכן על ידי פריימר (DT) T7-אוליגו, אשר נקשר את רצף פולי-A בסוף &#39;3 של ה-RNA תחושה שנוצר בתגובה שעתוק שקדמו הפוך. תגובה נוספת IVT מתבצע באותו אופן כמו בסיבוב הראשון. בסיבוב השני הוא חזר על זה בדרך כלל לפחות פעם אחת להשיג שלושה סיבובים של הגברה מתא בודד. יישומים טכניקות אשר הצגנו במאמר זה יכול להיות מתורגם למספר רב של יישומים. פרוטוקול יחיד בידוד תא יכול להיות שונה לשימוש פרוסות חריפה. 14 למרות שטכנית יותר מאתגר, אותם עקרונות יחולו כהכנה זה חלופי. בנוסף, אם הגודל של פיפטה מותאם מעט הקלטות של הפיזיולוגיה של התאים יכולה להתבצע לפני הקציר המאפשר חקירה מבוקר היטב של המנגנונים המולקולריים מאחורי פלטי פיזיולוגיים. עוד שינוי קל הוא לבודד תהליכים סומה התא. 15 עבור יישום זה, לאסוף גופות בתא עם פיפטה אחת ולאחר מכן לחזור עם טפטפת טריים לאסוף 100-300 dendrit מזוההes או אקסונים לכל צינור האיסוף. 16 לאחר התאים נקצרו, השוואות שכיחותם של mRNA ויצירות יכול להתבצע בין שונים, גם בתוך אוכלוסיות תאים זהים. שילוב biotinylated-UTP לתוך ארנה בסיבוב השלישי מאפשר ניתוח microarray כדי לקבוע אלו שכיחותם היחסית mRNA. הרכב האוכלוסייה mRNA המקורי ניתן גם נקבע לאחר ההליך ארנה באמצעות רצף של הדור הבא. ארנה מוגבר יכול לשמש גם כדי לאשר את פנוטיפ התא המרה מחקרים בהם סט מלא של mRNAs מסוג אחד לתוך תא transfected סוג תא אחר כדי לגרום למעבר של פנוטיפ של סוג התא האחרון לתוך כי לשעבר, הליך שפותח על ידי המעבדה המכונה TIPeR. 17 מחקרים אלה הם שימושיים במיוחד עבור הלומדים מדינות מחלות פנוטיפים התא מחקרים כאלה מתקיימים כיום במעבדה. RT-PCR או qPCR יכול להתבצע על החומר מוגבר כדי לאשר את הביטוי של גנים ספציפיים בתא. בנוסף, הערכות של היעילות של transfection או התמרה יכול להתבצע ברמת תא בודד. יתרונות ומגבלות כאמור באופן מופשט, בידוד של תאים בודדים לניתוח מבטל את ההשפעות בממוצע ראיתי עם ניתוח של אוכלוסיות תאים הטרוגנית. תופעות בממוצע לסלף שכיחותם mRNA בתוך תא בודד על ידי יתר המייצג תמלילי שפע בממוצע בחוץ ומניעת גילוי נמוכה שפע תעתיקים רבים. Cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי למיין תאים בודדים, אך שיטה זו דורשת ידע סמנים ספציפיים של התא וציוד יקר. ללכוד 18 microdissection לייזר או עם UV או IR microdissection מערכות לייזר ללכוד לאפשר תא בודד ואפילו ללכוד subcellular אבל דורש תאים עניין להיות ממוקם על פני השטח של חלקים דק מאוד. 19 בדומה cytometry זרימה, microdissection לייזר ללכוד גם דורש ציוד יקר. אחד היתרונות העיקריים של השיטה אלקטרודה מבוסס אוסף שתוארו לעיל היא כי נתונים אלקטרו יקר ניתן להשיג התא עניין לפני הקציר, דבר המאפשר ניתוח פונקציונלי transcriptome להתבצע על באותו תא. 20 החיסרון של הטכניקה שלנו זה דורש ניסיון באמצעות micromanipulators. החוקרים מכירים micromanipulators ימצאו טכניקה זו מאוד אינטואיטיבי, עם זאת, אנשים עם ניסיון כזה צריך להיות נוח עם התנועות בסדר הנדרש. הטמון בטכניקה כל הגברה היא הגברה מועדף של תמלילי מסוימים על סמך גודל והרכב נוקלאוטיד. 4,6,7 שרשרת פולימראז התגובה (PCR) טכניקות המבוססות כגון תגובה הפוכה תעתיק פולימראז שרשרת (RT-PCR) ו הגברה המהירה של cDNA מסתיים (RACE) לגרום הגברה אקספוננציאלית של תמלילי, בעוד ההליך הגברה תוצאות ארנה ב הגברה ליניארית. לכן, אחד היתרונות הגדולים של ההליך ארנה הוא ביכולת טובה יותר לשמר את שכיחותם היחסית של תעתיקי mRNA רק באופן ליניארי על ידי הגברה שגיאות או הטיות המתרחשות בתהליך הגברה בניגוד הגברה אקספוננציאלית אמר שגיאות הטיות. ההליך ארנה בשילוב עם ניתוח microarray מאפשר להשוות את שכיחותם mRNA בין תאים בודדים של מורפולוגיה דומה או שונה, או מטופלים מטופל. בנוסף, חומר מוגבר ניתן להגיש עבור סידור הדור הבא. 5,8 עם זאת, יש להיזהר בניתוחים כאלה שכן, בניגוד לשימוש primers אקראי עבור ההליך, את ההליך אוליגו DT-דרוך שתוארו לעיל הגברה הטיות של &quot;3 הקצוות של ה-mRNA, ובדרך כלל התוצאות קיצור קל של חומר מוגבר לאחר מכן עם כל סיבוב. יש להקפיד בניתוח תוצאות microarray עם שיטות סטנדרטיות כמו כמה שיחות נעדר שווא יכול לנבוע חומר מוגבר מקוצרת מעט. בנוסף, תוצאות תוך רצף אכן מספקים את מלוא 5 &quot;רצף של רוב mRNA המקורי, 5&quot; רצפים של mRNA מסוימים עשויים לפספס. מסיבות אלה, מספר סיבובים של amplifications צריך להיות מוגבל.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Spiegelgas coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological</td>
<td>63-3029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nunc 35x10 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-90</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water for cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-724Q</td>
<td>For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>6407</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>354239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Boric acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B0252</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and glutamax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41090-101</td>
<td>For plating cells</td>
</tr>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horse serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C1768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095-098</td>
<td>For growing cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 serum-free supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimble Chase</td>
<td>34500 99</td>
<td>Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. </td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175</td>
<td>Any solution will work as long as the components won&#x2019;t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)</td>
</tr>
<tr>
<td>1ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309628</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gauge depends on the diameter of the pipettes</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>28-4065-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dt-T7 oligo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom</td>
<td>Midland Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Second strand buffer (5x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Y01129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supplied with second strand buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>E.coli DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100002324</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA polymerase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004926</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnase H</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18021-071</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Megascript T7 kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Random primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BMB</td>
<td>11034731001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>56575</td>
<td>in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT</td>
</tr>
<tr>
<td>MEGAclear Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>1908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28206</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004994</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnasin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N251B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AMIL1791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-87</td>
<td>Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipette Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>MP-S15A</td>
<td>Will vary with micromanipulator and pipette O.D.</td>
</tr>
<tr>
<td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>5067-1511</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transcriptome analysis of single cells

ביטוי גנים רבים מסתמכים על טכניקות ניתוח חומר מבודד אוכלוסיות הטרוגנית של תאים או רקמות homogenates התאים בתרבית. 1,2,3 במקרה של המוח, אזורים כמו ההיפוקמפוס מכילים הסדר מורכב של תאים מסוגים שונים, כל אחד עם mRNA פרופילים שונים. היכולת קציר תאים בודדים מאפשר יותר בחקירה לעומק את ההבדלים מולקולרית בין ובתוך אוכלוסיות תאים. אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה של קצירת התאים לעיבוד נוסף. Pipettes משמש לעיתים קרובות electrophysiology מנוצלים לבודד (באמצעות שאיפה) תא עניין ובנוחות להפקיד אותו לתוך צינור Eppendorf לעיבוד נוסף עם כל מספר של טכניקות הביולוגיה המולקולרית. פרוטוקול שלנו יכול להיות שונה לקציר של דנדריטים של תרבית תאים או אפילו תאים בודדים מתוך פרוסות חריפה. כמו כן, אנו מתארים את שיטת הגברה ארנה כיישום הזרם העיקרי של isolations תא בודד. שיטה זו פותחה בעבר כחלופה אחר ביטוי גנים טכניקות ניתוח כגון שעתוק, הפוך או בזמן אמת שרשרת התגובה פולימראז (PCR) על ידי המעבדה שלנו. 4,5,6,7,8 טכניקה זו מאפשרת הגברה ליניארית של RNA polyadenylated החל femtograms רק של החומר וכתוצאה מכך כמויות מיקרוגרם של antisense RNA. החומר מוגבר באופן ליניארי מספקת הערכה מדויקת יותר מאשר הגברה PCR מעריכי השפע היחסי של מרכיבי transcriptome של התא המבודד. ההליך הבסיסי מורכב משני סיבובים של הגברה. בקצרה, RNA פולימראז אתר מקדם T7 הוא שולב cDNA גדילי כפול נוצר מתוך תמלילי mRNA. לילה שעתוק במבחנה (IVT) התגובה מתבצעת לאחר מכן שבה T7-RNA פולימראז מייצר תמלילי antisense רבים מן cDNA גדילי כפול. הסיבוב השני חוזר על התהליך הזה, אבל עם כמה הבדלים טכניים מאז חומר המוצא היא antisense RNA. זהו תקן לחזור על הסיבוב השני, וכתוצאה מכך שלושה סיבובים של הגברה. לעתים קרובות, בסיבוב השלישי בתגובה שעתוק במבחנה מבוצע באמצעות triphosphates nucleoside biotinylated כך RNA antisense המיוצר יכול להיות הכלאה ו זוהה על microarray. 7,8

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome Analysis of Single Cells at JoVE.com

Transcriptome Analysis of Single Cells

במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה קצירת של תאים בודדים מתרבויות עכברוש העיקרי העצבית וניתוח transcriptome הבאים באמצעות הגברה ארנה. גישה זו היא להכליל לכל סוג תא.

ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

ניתוח של תאים חיסוניים העצבים ממוגלה יחיד, גנגליון העזוב השורש של עכבר אחת באמצעות Cytometry זרימה

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

ניתוח של לוקליזציה של הספולקסיזומאואליזציה של האדם בתאי הלה באמצעות מיקרו הזרקה

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

מודל מדרגי לחקר ההשפעות של פגיעה בוטה בכוח בדגי זברה בוגרים

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...