Name: transcriptome analysis of single cells
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00
Duration: 7 min 27 s
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Grazie a voi Kevin Miyashiro per la placcatura e il mantenimento di colture cellulari, al Dott. Terri Schochet per la fornitura di colture cellulari per le immagini incluse in questo documento. Inoltre, grazie a Kevin Miyashiro, Dr. Peter Buckley, e Tiina Pertiz per l&#39;ingresso sulla procedura ARNA. Il finanziamento per questo lavoro è stato dal National Institute on Aging, l&#39;Istituto Nazionale per la Salute Mentale e Risorse Umane fondi Fact Finder dal Commonwealth della Pennsylvania.

<ol>
	<li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury.">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li><li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+biology.">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li><li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1:+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity.">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li><li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology.">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li><li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis:+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders.">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li><li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+synthesis+in+situ:+methods+and+applications.">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li><li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li><li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration.">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-1000 &#38; P-97 Pipette Cookbook. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , 28-29 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Megascript kit. , 7-8 .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MEGAclear kit. , 4-5 .</li><li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells.">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li><li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis:+Implications+for+neuronal+functioning.">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li><li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype.">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li><li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis:+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+(PREXCEL-Q).">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li><li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li><li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy.">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li></ol>

Dr. Eberwine è un inventore sul brevetto ARNA che ha ottenuto la licenza per le tecnologie LBS in cui il Dr. Eberwine è un azionista.

Note e risoluzione dei problemi <ul><li> Si consiglia di assumere prima e dopo le immagini mostrano che la cellula bersaglio è stato isolato e che la penombra rimanente è stato lasciato intatto. </li><li> Se troppa soluzione sta entrando la pipetta come sei raccolta, è possibile utilizzare 3 vie Luer-Lock raccordi e lo stantuffo della siringa per tenere a pressione positiva nelle tubazioni. Il volume desiderato varia a seconda del tipo di lavorazione, ma fino a 5 microlitri dovrebbe andare bene per la maggior parte delle applicazioni. </li></ul> Consigli generali su tecniche di biologia molecolare <ul><li> Vortex tutti i tubi magazzino e spin giù prima di aggiungere ad una reazione. MAI enzimi vortice. </li><li> Mescolare bene le reazioni prima di aggiungere l&#39;enzima per garantire che il buffer è alla giusta concentrazione. </li><li> Mantenere le scorte di enzimi a -20 ° C se possibile usando un stratacooler. In caso contrario, rimuovere destra prima dell&#39;uso, tenere su ghiaccio, e tornare immediatamente a -20 ° C. </li><li> Sempre fare Master Mix quando si prepara più di una reazione per ridurre gli errori di pipettamento. Calcolare il volume richiesto in base al numero di campioni e aggiungere 10-20%. </li><li> Conservare l&#39;RNA a -80 ° C a ritardare il degrado. L&#39;RNA è più stabile memorizzati nel buffer per apurination ritardare di RNA che si verifica in condizioni di acidità. </li></ul> Schema generale della procedura ARNA Figura 4A illustra il primo round della procedura di Arna. Nella reazione primo filone, la poli-T porzione di T7-oligo (dT) primer seleziona per le specie di mRNA (lungo rettangolo bianco) legandosi alla coda polyA. Alcuni microRNA sono anche polyadenylated e saranno catturati da questa procedura. Ancora più importante, tuttavia, l&#39;RNA più abbondante nella cellula, RNA ribosomiale, no. Questo oligo funge da primer per trascrittasi inversa per sintetizzare un filamento complementare del cDNA (rettangolo grigio lungo) con l&#39;mRNA come modello. La parte del T7 T7-oligo (dT) primer incorpora il promotore T7 RNA polimerasi a telaio con la sequenza antisenso per l&#39;mRNA di partenza. Questo è utilizzato in seguito nella reazione di trascrizione in vitro. Successivamente, l&#39;mRNA in mRNA / DNA ibrido creato nel passaggio precedente è parzialmente idrolizzato dalla RNasi H creando RNA &quot;primer&quot; (piccoli rettangoli bianchi) simile ai frammenti di Okazaki creato nella sintesi del filamento di DNA in ritardo di sviluppo. DNA polimerasi I utilizza frammenti di RNA di sintesi del DNA primi utilizzando il DNA complementare al mRNA come modello. Quando raggiunge il frammento successivo RNA, i suoi 5 &#39;a 3&#39; nucleasica rimuove il ribonucleotidi e li sostituisce con deossiribonucleotidi. La DNA ligasi è aggiunto a legare ogni filoni in cui la sostituzione del filo guida non è completa. DNA polimerasi T4 è aggiunta per riempire nelle zone in cui frammenti di RNA servito come primer iniziale per la DNA polimerasi I creando un blunt-ended a doppio filamento cDNA che viene poi purificato prima di effettuare la reazione IVT. Nella reazione IVT, T7 RNA polimerasi si lega al promotore T7 incorporato nella doppia elica del DNA e sintetizza le molecole di RNA antisenso (lunghi rettangoli neri) con il senso del filo come modello. Questo serve come il passo di amplificazione in cui si producono migliaia di molecole di RNA antisenso da ogni molecola doppio filamento del DNA (Figura 4A). Il secondo turno, come illustrato nella figura 4B, inizia con una reazione di trascrizione inversa che è leggermente diverso da quello del primo turno dato che di partenza è l&#39;RNA antisenso (solido rettangolo nero) e manca la coda polyadenylated che è stato interessato dagli T7-oligo (dT) primer al primo turno. Pertanto, questa reazione è innescata con primer random (piccoli rettangoli grigi) e successivamente denaturato RNA. La reazione secondo filone è poi innescata dalla T7-oligo (dT) primer, che si lega alla poli-Una sequenza all&#39;estremità 3 &#39;dell&#39;RNA senso creati nella reazione precedente trascrizione inversa. Un&#39;altra reazione IVT viene eseguita nello stesso modo come nel primo turno. Il secondo turno è di solito ripetuta almeno una volta per raggiungere tre turni di amplificazione da una singola cellula. Applicazioni Le tecniche che abbiamo presentato in questo articolo può essere tradotto in un gran numero di applicazioni. Il singolo protocollo di isolamento delle cellule possono essere modificati per essere utilizzati in fette acuta. 14 Anche se tecnicamente più impegnativi, gli stessi principi si applicano in questa preparazione alternativa. Inoltre, se la dimensione della pipetta è leggermente adattato, registrazioni della fisiologia delle cellule può essere fatta prima della raccolta consentendo una ben controllata studio dei meccanismi molecolari alla base uscite fisiologiche. Un&#39;altra piccola modifica è quello di isolare i processi dal soma cellulare. 15 Per questa applicazione, raccogliere corpi cellulari con una pipetta e poi tornare con una pipetta fresca e raccogliere 100-300 dendrit identificatoes o assoni al tubo di raccolta 16. Una volta che le cellule sono state raccolte, i confronti di abbondanze mRNA e composizioni può essere fatta tra diverse e anche all&#39;interno della popolazione stessa cella. Incorporando biotinilato-UTP nel ARNA terzo turno per l&#39;analisi dei microarray permette di determinare questi mRNA abbondanze relative. La composizione della popolazione mRNA originale può essere determinata anche dopo la procedura ARNA utilizzando sequenziamento di nuova generazione. L&#39;ARNA amplificato può essere utilizzato anche per confermare il fenotipo delle cellule studi di conversione in cui vengono transfettate una serie completa degli mRNA da un tipo di cellula in un tipo cellulare diverso al fine di indurre transizione del fenotipo del tipo di cellula quest&#39;ultima in quella dei primi, una procedura sviluppata dal laboratorio e conosciuto come Tiper. 17 Questi studi sono particolarmente utili per lo studio di stati di malattia e fenotipi cellulari e tali studi sono attualmente in corso in laboratorio. RT-PCR o qPCR può essere eseguita sul materiale amplificato per confermare l&#39;espressione di specifici geni delle cellule. Inoltre, le valutazioni di efficienza di trasfezione o trasduzione può essere fatta a livello di singola cellula. Vantaggi e limiti Come affermato in astratto, l&#39;isolamento di singole cellule per l&#39;analisi elimina gli effetti media visto con l&#39;analisi di popolazioni cellulari eterogenee. Questi effetti media travisare abbondanze mRNA all&#39;interno di una singola cellula da un eccesso di rappresentanza trascrizioni abbondante e mediazione e la prevenzione di molte rilevamento a basso abbondanza trascrizioni. Citometria a flusso può essere utilizzato per ordinare le singole cellule, ma questo metodo richiede la conoscenza di marcatori specifici delle cellule e costose attrezzature. 18 microdissezione catturare laser sia con sistemi di acquisizione IR o UV microdissezione laser permettono di singola cellula e perfino catturare subcellulare, ma richiede cellule di interesse per essere situati sulla superficie delle sezioni molto sottili. 19 Simile alla citometria a flusso, microdissezione laser capture richiede costose attrezzature. Uno dei principali vantaggi della tecnica di base collezione elettrodo sopra descritti è che importanti dati elettrofisiologici possono essere ottenute dalla cella di interesse prima del raccolto, permettendo l&#39;analisi funzionale del trascrittoma e da eseguire sulla cella stessa. 20 A lato negativo della nostra tecnica è che richiede esperienza nell&#39;uso di micromanipolatori. Gli investigatori familiarità con micromanipolatori troveranno questa tecnica molto intuitivo, tuttavia, gli individui con nessuna esperienza quali sarà necessario per familiarizzare con i movimenti fini necessari. Inerenti a qualsiasi tecnica di amplificazione è l&#39;amplificazione preferenziale di alcune trascrizioni in base alle dimensioni e alla composizione dei nucleotidi. 4,6,7 reazione a catena della polimerasi (PCR), tecniche di base come reverse-trascrizione reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) e la rapida amplificazione di cDNA estremità (RACE) comportano l&#39;amplificazione esponenziale di trascrizioni, mentre l&#39;ARNA procedura di amplificazione risultati di amplificazione lineare. Così, uno dei principali vantaggi della procedura ARNA risiede nella sua capacità di preservare meglio l&#39;abbondanza relativa di mRNA trascritti da solo linearmente amplificando eventuali errori o distorsioni che si verificano nel processo di amplificazione al contrario di amplificare esponenzialmente detto errori e pregiudizi. La procedura ARNA accoppiata con analisi microarray permette la comparazione delle abbondanze mRNA tra singole cellule di morfologia simili o differenti, trattati o non trattati. Inoltre, il materiale amplificato possono essere presentate per il sequenziamento di nuova generazione. 5,8 Tuttavia, occorre prestare attenzione a queste analisi in quanto, in contrasto con l&#39;uso di primer a caso per la procedura, l&#39;oligo-dT primer procedura sopra descritta amplificazione pregiudizi del 3 &#39;estremità del mRNA e in genere si traduce in un accorciamento leggera successive materiale amplificato con ogni turno. Si deve prestare attenzione nel valutare i risultati dei microarray con metodi standard come alcune false chiamate assenti possono derivare da un po &#39;accorciato materiale amplificato. Inoltre, i risultati mentre sequenziamento sarà davvero fornirà la piena 5 &#39;sequenza della maggior parte degli mRNA originale, il 5&#39; sequenze di alcuni mRNA possono perdere. Per queste ragioni, il numero di giri di amplificazioni dovrebbe essere limitato.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Spiegelgas coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological</td>
<td>63-3029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nunc 35x10 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-90</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water for cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-724Q</td>
<td>For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>6407</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>354239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Boric acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B0252</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and glutamax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41090-101</td>
<td>For plating cells</td>
</tr>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horse serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C1768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095-098</td>
<td>For growing cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 serum-free supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimble Chase</td>
<td>34500 99</td>
<td>Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. </td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175</td>
<td>Any solution will work as long as the components won&#x2019;t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)</td>
</tr>
<tr>
<td>1ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309628</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gauge depends on the diameter of the pipettes</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>28-4065-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dt-T7 oligo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom</td>
<td>Midland Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Second strand buffer (5x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Y01129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supplied with second strand buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>E.coli DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100002324</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA polymerase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004926</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnase H</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18021-071</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Megascript T7 kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Random primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BMB</td>
<td>11034731001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>56575</td>
<td>in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT</td>
</tr>
<tr>
<td>MEGAclear Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>1908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28206</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004994</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnasin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N251B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AMIL1791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-87</td>
<td>Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipette Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>MP-S15A</td>
<td>Will vary with micromanipulator and pipette O.D.</td>
</tr>
<tr>
<td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>5067-1511</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transcriptome analysis of single cells

Molte tecniche di analisi di espressione genica si basano su materiale isolato da popolazioni eterogenee di cellule da omogenati di tessuti o cellule in coltura. 1,2,3 Nel caso del cervello, regioni come l&#39;ippocampo contiene una disposizione complessa di diversi tipi di cellule, ciascuna con profili di mRNA distinte. La capacità di raccogliere le singole cellule consente una più approfondita indagine sulle differenze molecolari tra e all&#39;interno di popolazioni cellulari. Descriviamo un metodo semplice e rapido per la raccolta delle cellule per ulteriori elaborazioni. Pipette spesso usato in elettrofisiologia sono utilizzati per isolare (con aspirazione) una cella di interesse e convenientemente lo depositano in una provetta Eppendorf per l&#39;ulteriore elaborazione con qualsiasi numero di tecniche di biologia molecolare. Il nostro protocollo può essere modificato per la raccolta dei dendriti da colture cellulari o anche singole cellule da fette acuta. Abbiamo anche descrivere il metodo di amplificazione ARNA come applicazione principale a valle di isolamenti singola cellula. Questo metodo è stato sviluppato in precedenza dal nostro laboratorio come alternativa alle altre tecniche di analisi dell&#39;espressione genica come reverse-trascrizione o real-time polymerase chain reaction (PCR). 4,5,6,7,8 Questa tecnica prevede l&#39;amplificazione lineare dei polyadenylated RNA a partire femtogrammi solo del materiale e conseguente quantità microgrammo di RNA antisenso. Il materiale linearmente amplificato fornisce una più accurata stima di amplificazione esponenziale della relativa abbondanza di componenti del trascrittoma delle cellule isolate. La procedura di base consiste in due turni di amplificazione. In breve, un RNA polimerasi di T7 sito promotore è incorporata nel doppio filamento del DNA creati dal verbale mRNA. Una notte nella trascrizione in vitro (IVT) di reazione viene quindi eseguita in cui T7 RNA polimerasi produce molte trascrizioni antisenso dal cDNA a doppio filamento. Il secondo turno si ripete questo processo, ma con alcune differenze tecniche, poiché il materiale di partenza è l&#39;RNA antisenso. E &#39;normale ripetere il secondo turno, con conseguente tre turni di amplificazione. Spesso, il terzo turno in reazione trascrizione in vitro viene eseguita utilizzando nucleosidi trifosfati biotinilato in modo che il RNA antisenso prodotta può essere ibridato e rilevato su un microarray. 7,8

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Transcriptome Analysis of Single Cells

In questo articolo viene descritto un metodo semplice per la raccolta di singole cellule di ratto colture primarie neuronali e analisi del trascrittoma con conseguente amplificazione ARNA. Questo approccio è generalizzabile a qualsiasi tipo di cellula.

L&#39;analisi del trascrittoma di singole cellule

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Ricerca

Neuroscienze

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential Photo-sbiancante per Delineare cellule di Schwann singoli sulla giunzione neuromuscolare

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Sequenza RNA a singola cellula di sottogruppi definiti delle cellule del Ganglio retinico

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analisi delle cellule immuni in singolo nervo sciatico e del ganglio della radice dorsale da un singolo Mouse mediante citometria a flusso

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Analisi della localizzazione snRNA Spliceosomic nelle cellule umane di Hela utilizzando la microiniezione

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Un modello scalabile per studiare gli effetti della lesione da forza smussata nel pesce zebra adulto

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...