Name: transcriptome analysis of single cells
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00
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この文書に含まれている映像のために細胞培養を提供するための博士テリーSchochetに、細胞培養をめっきし、維持するためにケビン宮代に感謝。さらに、aRNAの手順で入力するためのケビン宮代、ピーターバックリー、およびティーナPertizにありがとう。この作業のための資金は国立老化研究所、精神保健及びペンシルベニア州の連邦からの人事ファクトファインダーファンドの国立研究所からだった。

<ol>
	<li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury.">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li><li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+biology.">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li><li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1:+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity.">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li><li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology.">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li><li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis:+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders.">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li><li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+synthesis+in+situ:+methods+and+applications.">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li><li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li><li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration.">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-1000 &#38; P-97 Pipette Cookbook. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , 28-29 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Megascript kit. , 7-8 .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MEGAclear kit. , 4-5 .</li><li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells.">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li><li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis:+Implications+for+neuronal+functioning.">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li><li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype.">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li><li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis:+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+(PREXCEL-Q).">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li><li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li><li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy.">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li></ol>

博士はEberwineは博士Eberwineが、株主であるLBS技術にライセンスされているaRNAの特許の発明者です。

注意事項とトラブルシューティング<ul><li>あなたは前と後に標的細胞が単離されたことを示す画像と、残りの半影はそのまま残されたものになるとよいでしょう。 </li><li>あなたが収穫されるためあまり解決策は、ピペットを入力している場合は、3ウェイルアーロックフィッティングとチューブに正圧を保持するシリンジ用プランジャーを使用することができます。任意のボリュームは、処理の種類によって異なりますが、最大5μlのは、ほとんどのアプリケーションで問題ないはずです。 </li></ul>分子生物学的手法の一般的なヒント<ul><li>渦すべての株式のチューブを、反応に添加する前に、それらをスピンダウン。 NEVER渦酵素。 </li><li>徹底的にバッファが適切な濃度であることを保証するために酵素を加える前に反応を混ぜる。 </li><li>可能であればstratacoolerを使用して-20℃で酵素の在庫を保管してください。そうでない場合は、、右使用前に取り外して氷上に保持し、-20℃にすぐに戻ります</li><li>常にピペッティングエラーを減らすために複数の反応を準備する時、マスターミックスのこと。サンプル数に基づいて必要な量を計算すると10-20％を追加。 </li><li>店舗RNA -80 ° Cを遅らせる劣化へ。 RNAは酸性条件下で発生するRNAのa​​purinationを遅らせるためにバッファに格納されている最も安定しています。 </li></ul> aRNAの手順の一般的な概要図4Aは、aRNAの手順の最初のラウンドを示しています。第一鎖の反応では、T7 - oligo（dT）プライマーのポリ- T部分は、ポリA尾部に結合することによってmRNA種（長い白い長方形）のために選択されます。いくつかのマイクロRNAは、ポリアデニル化されると、このプロシージャによって取得されます。さらに重要なことは、しかし、細胞の中で最も豊富なRNAは、リボソームRNAは、しません。このオリゴは、テンプレートとしてmRNAを用いたcDNA（長い灰色の長方形）の相補鎖を合成する逆転写酵素のためのプライマーとして機能します。 T7 -オリゴ（dT）プライマーのT7の部分は、開始mRNAに配列をアンチセンスでフレーム内のT7 RNAポリメラーゼプロモーターが組み込まれています。これは、in vitroでの転写反応の後半で使用されています。 次に、前の手順で作成した発現/ DNAハイブリッド中のmRNAは、ラギング鎖のDNA合成で作成された岡崎フラグメントと同様のRNA&quot;プライマー&quot;を（小さな白い長方形）を作成RNアーゼHによって部分的に加水分解される。 DNAポリメラーゼは、私がテンプレートとしてmRNAに相補的なDNAを使用してプライムDNA合成にRNA断片を使用しています。それは次のRNA断片に到達すると、その5&#39;から3&#39;ヌクレアーゼ活性は、リボヌクレオチドを​​除去し、デオキシリボヌクレオチドに置き換えます。 DNAリガーゼは、リーディング鎖の交換が​​完了していない任意の鎖を連結するために追加されます。 RNA断片は、DNAポリメラーゼIが作成するための最初のプライマーとして役立ったところ、T4 DNAポリメラーゼは、エリアを埋めるために追加されて平滑末端に二重次にIVT反応を実行する前に精製される二本鎖cDNAを。 IVT反応では、T7 RNAポリメラーゼは、鋳型としてセンス鎖を使って二重鎖cDNAと合成するアンチセンスRNA分子（長い黒い長方形）に組み込まれたT7プロモータに結合する。これは、アンチセンスRNA分子の数千が各二本鎖cDNA分子（図4A）から生成される増幅のステップとして機能します。 図4Bに示すように第二ラウンドは、、出発RNAはアンチセンス（黒く塗りつぶした矩形）であるとT7 -オリゴの標的にされたポリアデニル化した尾部を欠いているので、最初のラウンドのそれとは若干異なる逆転写反応から始まり、最初のラウンドで（dT）プライマー。したがって、この反応は、ランダムプライマー（小さなグレーの長方形）と続いて変性RNAを発揮する。第二鎖の反応は、前述の逆転写反応で作成したセンスRNAの3&#39;末端にポリA配列に結合するT7 -オリゴ（dT）プライマーでプライミングされています。別のIVT反応は、最初のラウンドと同様に実行されます。この第二ラウンドは、通常、単一の細胞から増幅3回を達成するには、少なくとも一回繰り返されます。 アプリケーション我々はこの記事で紹介されていることの技術は多数のアプリケーションに変換することができます。単一細胞の単離のプロトコールは、急性スライスで使用するために変更することができます。14技術的に困難なものの、同じ原則が、この代替の準備に適用されます。ピペットのサイズが若干調整されている場合はさらに、細胞の生理機能の録音は、収穫が生理的な出力の背後にある分子メカニズムの十分に制御された調査を許可する前に行うことができます。別の若干の修正は15が 、このアプリケーションでは。細胞体からプロセスを分離することになってピペットで細胞体を収集し、新鮮なピペットで戻って、100から300に識別dendritを収集するESまたはコレクションチューブあたり軸索。。16 一度細胞が収穫されて、mRNAの存在量と組成の比較は、同一の細胞集団内でも異なるとの間で行うことができます。第三ラウンドにビオチン- UTPを組み込んだaRNAのは、これらの相対的なmRNAの存在量を決定するためにマイクロアレイ解析が可能になります。オリジナルのmRNAの人口の組成物はまた、次世代シーケンシングを使用してaRNAの手順の後に決定することができます。増幅されたaRNAを、前者のように後者の細胞型の表現型の変化を誘導するために、ひとつの細胞型からのmRNAの完全なセットが異なる細胞型にトランスフェクトされた細胞の表現型の変換の研究を確認するためにも使用できます。手順ラボが開発し、TIPeRとして知られている。17これらの研究は、病気の状態や細胞の表現型とそのような研究を研究するために特に有用であるが、ラボで現在進行中です。 RT - PCRや定量PCRは、細胞特異的遺伝子の発現を確認するために増幅された材料で行うことができます。さらに、トランスフェクションまたは形質導入の効率性の評価は、単一細胞レベルで行うことができます。 利点と制限事項抽象的に記載されているように、分析のための単一細胞の単離は、異種細胞集団の解析で見られる平均化の効果がなくなります。これらの平均化の効果は、豊富な転写を過剰表現して平均化し、多くの発現量の低い転写産物の検出を防止することにより、単一細胞内のmRNAの存在量を偽る。フローサイトメトリーは、個々のセルを並べ替えるために使用されますが、この方法は、細胞特異的マーカーと高価な機器の知識が必要です。18レーザーキャプチャーマイクロダイセクションはどちらUVやIRレーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムと単一のセル、さらには細胞内取り込みを可能にするだけの目的の細胞を必要とすることができます非常に薄い切片の表面に位置する。19はフローサイトメトリーと同様に、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションはまた、高価な機器が必要です。 上記の電極ベースのコレクションの技術の主な利点の1つは、その貴重な電気生理学的データが同じセルで実行される機能性とトランスクリプトーム解析を可能にする、収穫の前に目的の細胞から得ることができるからである。私たちの技術の20の欠点があるそれは、マニピュレーターを使用して経験を必要としないこと。マイクロマニピュレータに精通して研究者らは、このテクニックは非常に直感的にわかりますが、そのような経験を持つ個人が必要な細かい動きに慣れる必要があります。 任意の増幅技術に内在するには、サイズと塩基組成に基づいて特定の転写産物の選択的増幅です。4,6,7ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT - PCR）、cDNAの迅速増幅のようなベースのテクニックは線形増幅のaRNAの増幅法の結果、一方の端（RACE）の転写産物の指数関数的増幅の結果、。このように、aRNAの手順の主要な利点の一つは、より指数関数的に増幅するのではなく、唯一の直線的に増幅過程で発生したエラーやバイアスを増幅することによってmRNAの転写産物の相対的存在量を維持する能力にあるエラーやバイアスは言った。 マイクロアレイ解析と相まってaRNAの手順は、処理または未処理同様のまたは別の形態の単セル間のmRNAの存在量の比較ができます。さらに、増幅された材料は、次世代シーケンシングのために提出することができます。5,8がしかし、、手続きのためのランダムプライマーを使用することとは対照的に、オリゴ- dTプライミング手順はの偏見の増幅上記以来、このような分析には注意が必要mRNAおよび各ラウンドで、その後の増幅された物質のわずかな短縮で、一般的に、結果の3&#39;末端。ケアは、いくつかの偽の不在コールが若干短縮増幅された物質から発生することができるように標準的な方法とマイクロアレイの結果を分析することに注意してください。さらに、シーケンシングの結果は確かに全5提供する間、&quot;オリジナルのmRNAのほとんどのシーケンスを、5&#39;いくつかのmRNAのシーケンスが見逃される可能性があります。これらの理由により、増幅のラウンド数を制限する必要があります。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Spiegelgas coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological</td>
<td>63-3029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nunc 35x10 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-90</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water for cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-724Q</td>
<td>For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>6407</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>354239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Boric acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B0252</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and glutamax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41090-101</td>
<td>For plating cells</td>
</tr>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horse serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C1768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095-098</td>
<td>For growing cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 serum-free supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimble Chase</td>
<td>34500 99</td>
<td>Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. </td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175</td>
<td>Any solution will work as long as the components won&#x2019;t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)</td>
</tr>
<tr>
<td>1ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309628</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gauge depends on the diameter of the pipettes</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>28-4065-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dt-T7 oligo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom</td>
<td>Midland Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Second strand buffer (5x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Y01129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supplied with second strand buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>E.coli DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100002324</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA polymerase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004926</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnase H</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18021-071</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Megascript T7 kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Random primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BMB</td>
<td>11034731001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>56575</td>
<td>in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT</td>
</tr>
<tr>
<td>MEGAclear Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>1908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28206</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004994</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnasin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N251B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AMIL1791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-87</td>
<td>Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipette Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>MP-S15A</td>
<td>Will vary with micromanipulator and pipette O.D.</td>
</tr>
<tr>
<td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>5067-1511</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transcriptome analysis of single cells

多くの遺伝子発現解析の技術は文化の組織ホモジネートまたは細胞からの細胞の不均一な集団から分離された材料に依存している。1,2,3の脳の場合には、このような海馬などの領域はそれぞれに、異なる細胞型の複雑な配置が含まれています異なるmRNAプロファイル。単一の細胞を回収する能力は、細胞集団間および内の分子の違いに綿密な調査で、より可能になります。我々は、さらなる処理のために細胞を採取するための簡便かつ迅速な方法を説明します。多くの場合、電気生理学で使用されているピペットは（誤嚥を使用して）目的の細胞を分離し、便利な分子生物学的手法の任意の数のさらなる処理のためのエッペンドルフチュー​​ブに、それを堆積させるために利用されています。我々のプロトコルは、細胞培養または急性スライスからさらには個々の細胞からの樹状突起の収穫に変更することができます。 我々はまた、単一のセルのアイソレーションの主要な下流のアプリケーションとしてaRNAの増幅法を説明します。このメソッドは、逆転写反応またはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの他の遺伝子発現解析の手法に代わるものとして私たちの研究室で以前に開発されました。4,5,6,7,8この手法ではのリニア増幅を提供するポリアデニル化RNAは、材料の唯一のフェムトグラムから始まり、アンチセンスRNAのマイクログラム量で生じる。直線的に増幅された材料は、単離細胞のトランスクリプトームの成分の相対量のPCRの指数増幅よりも正確な推定を提供します。基本的な手順は、増幅の二回で構成されています。簡単に言うと、T7 RNAポリメラーゼプロモーターのサイトは、mRNA転写物から作成された二本鎖cDNAに組み込まれています。 in vitro転写一晩（IVT）反応は、T7 RNAポリメラーゼは、二本鎖cDNAから多くのアンチセンス転写産物を生成する実行されます。第二ラウンドでは、このプロセスを繰り返しますが、出発原料からいくつかの技術的な違いがアンチセンスRNAである。それは、増幅の3つのラウンドで、その結果、第二ラウンドを繰り返すことが標準です。多くの場合、in vitro転写反応の第三ラウンドは、生成されたアンチセンスRNAをハイブリダイズし、マイクロアレイで検出することができるようにビオチン化ヌクレオシド三リン酸を使用して実行されます。7,8

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の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

マイクロインジェクションを用いたヒトヘラ細胞におけるスプリセオソームsnRNA局在化の解析

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

成虫ゼブラフィッシュにおける鈍力損傷の影響を研究するスケーラブルモデル

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...