Name: transcriptome analysis of single cells
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00
Duration: 7 min 27 s
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Obrigado a Kevin Miyashiro para revestimento e manutenção de culturas de células, ao Dr. Terri Schochet para a prestação de culturas de células para as fotos incluídas neste documento. Além disso, obrigado a Kevin Miyashiro, Peter Dr. Buckley, e Pertiz Tiina para a entrada sobre o procedimento ARNA. Financiamento para este trabalho foi do Instituto Nacional do Envelhecimento, o Instituto Nacional de Saúde Mental e Recursos Humanos fundos Fact Finder a partir da Pensilvânia.

<ol>
	<li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury.">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li><li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+biology.">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li><li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1:+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity.">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li><li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology.">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li><li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis:+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders.">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li><li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+synthesis+in+situ:+methods+and+applications.">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li><li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li><li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration.">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-1000 &#38; P-97 Pipette Cookbook. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , 28-29 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Megascript kit. , 7-8 .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MEGAclear kit. , 4-5 .</li><li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells.">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li><li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis:+Implications+for+neuronal+functioning.">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li><li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype.">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li><li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis:+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+(PREXCEL-Q).">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li><li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li><li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy.">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li></ol>

Dr. Eberwine é um inventor da patente ARNA que foi licenciado para LBS tecnologias em que Dr. Eberwine é um accionista.

Notas e solução de problemas <ul><li> Você pode querer tomar antes e depois de imagens mostrando que a célula-alvo foi isolado e que a penumbra restante foi deixado intocado. </li><li> Se demasiada solução é entrar na pipeta como você está colhendo, você pode usar 3 vias Luer-Lock e acessórios para o êmbolo da seringa para manter pressão positiva na tubulação. O volume desejado irá variar com o tipo de processamento, mas até 5 mL deve ser bom para a maioria das aplicações. </li></ul> Dicas gerais sobre técnicas da biologia molecular <ul><li> Vortex todos os tubos de ações e spin-las antes de adicionar a uma reação. NUNCA enzimas vortex. </li><li> Misturar bem reações antes de adicionar a enzima para garantir que o buffer está na concentração adequada. </li><li> Manter o estoque de enzimas a -20 ° C, se possível usando um stratacooler. Caso contrário, remova direito antes do uso, manter no gelo, e retornar imediatamente a -20 ° C. </li><li> Sempre fazer misturas de mestre na elaboração de mais de uma reação para reduzir os erros de pipetagem. Calcular o volume necessário com base no número de amostras e adicionar 10-20%. </li><li> Loja RNA a -80 ° C para a degradação retard. RNA é mais estável armazenados em buffer para retardar apurination de RNA que ocorre em condições ácidas. </li></ul> Esquema Geral do Procedimento ARNA Figura 4A ilustra a primeira rodada do processo de ARNA. Na reação de primeira vertente, a parcela de poli-T da T7-oligo primer (dT) seleciona para as espécies de mRNA (retângulo branco longo) ligando-se à cauda poli. Alguns microRNAs são também polyadenylated e será capturado por esse procedimento. Mais importante, porém, os RNAs mais abundante na célula, RNAs ribossomais, não. Este oligo funciona como um primer para transcriptase reversa para sintetizar uma fita complementar de cDNA (retângulo cinza longo) usando o mRNA como um modelo. A porção do T7 T7-oligo primer (dT) incorpora o promotor T7 RNA polimerase no quadro com a seqüência de antisense para o mRNA de partida. Esta é usada mais tarde na reação in vitro de transcrição. Em seguida, o mRNA no híbrido mRNA / DNA criado na etapa anterior é parcialmente hidrolisada por Rnase H criação de RNA &quot;primers&quot; (pequenos retângulos brancos), semelhante aos fragmentos Okazaki criado em síntese lagging strand DNA. DNA Polimerase I utiliza fragmentos de RNA para preparar a síntese de DNA usando o DNA complementar ao mRNA como um modelo. Quando atinge o fragmento de RNA que vem, seus 5 &#39;para 3&#39; atividade nuclease remove o ribonucleotídeos e substitui-los com desoxirribonucleótidos. DNA ligase é adicionado a qualquer ligadura vertentes em que a substituição da fita líder não está completo. Polimerase DNA T4 é adicionada para preencher as áreas onde fragmentos de RNA serviu como primers inicial para Polimerase DNA eu criar uma ponta e dupla fita de cDNA, que depois é purificado antes de realizar a reação IVT. Na reação IVT, T7 RNA polimerase se liga ao promotor T7 incorporados ao cDNA dupla fita e sintetiza moléculas de RNA antisense (long retângulos pretos), utilizando a vertente sentido como um modelo. Isto serve como etapa de amplificação em que milhares de moléculas de RNA antisense são produzidos a partir de cada molécula de cadeia dupla de cDNA (Figura 4A). A segunda rodada, conforme apresentado na Figura 4B, começa com uma reação de transcrição reversa, que é ligeiramente diferente da primeira rodada desde o RNA de partida é antisense (retângulo preto sólido) e não tem o rabo polyadenylated que foi alvo pela T7-oligo (dT) primário no primeiro turno. Portanto, essa reação é preparado com primers aleatórios (pequenos retângulos cinza) e posteriormente o RNA desnaturado. A reação segunda vertente é, então, preparado pela T7-oligo primer (dT), que se liga ao poli-A seqüência na extremidade 3 &#39;do RNA sentido criado na reação de transcrição reversa anteriores. Outra reação IVT é realizada na mesma maneira que no primeiro turno. Esta segunda ronda geralmente é repetido pelo menos uma vez para atingir três rounds de amplificação de uma única célula. Aplicações As técnicas que apresentamos neste artigo pode ser traduzido em um grande número de aplicações. O protocolo de isolamento única célula pode ser modificado para uso em fatias aguda. 14 Embora tecnicamente mais desafiador, os mesmos princípios se aplicam nesta preparação alternativo. Além disso, se o tamanho da pipeta é ligeiramente ajustada, as gravações da fisiologia das células pode ser feita antes da colheita permitindo uma investigação bem controlados dos mecanismos moleculares por trás saídas fisiológicas. Outra pequena modificação é isolar os processos da soma das células. 15 Para esta aplicação, recolher corpos celulares com uma pipeta e depois voltar com uma pipeta nova e recolher 100-300 Dendrit identificadoses ou axônios por tubo de coleta. 16 Uma vez que as células foram colhidas, as comparações de abundância de mRNA e composições podem ser feitas entre diferentes e mesmo dentro da mesma célula populações. Incorporando-biotinilado UTP no ARNA terceira rodada microarray permite a análise para determinar esses abundâncias mRNA relativo. A composição da população mRNA original pode também ser determinada após o procedimento ARNA utilizando seqüenciamento da próxima geração. O ARNA amplificados também podem ser usados ​​para confirmar os estudos de células fenótipo de conversão em que um conjunto completo de mRNAs de um tipo de célula são transfectadas em um tipo de célula diferente, a fim de induzir a transição do fenótipo do tipo de célula última em que do primeiro, um procedimento desenvolvido pelo laboratório e conhecido como TIPeR 17. Esses estudos são particularmente úteis para o estudo de estados de doença e fenótipos celulares e tais estudos estão em andamento no laboratório. RT-PCR ou qPCR pode ser realizada sobre o material amplificado para confirmar a expressão de genes específicos de células. Além disso, as avaliações da eficiência de transfecção ou transdução pode ser feita no nível da célula única. Vantagens e Limitações Como dito no resumo, o isolamento de células individuais para análise elimina os efeitos média de visto com a análise de populações de células heterogêneas. Estes efeitos média deturpar abundâncias mRNA em uma única célula por excesso de transcrições representando abundante e média para fora e evitar a detecção de muitos de baixa abundância transcrições. Citometria de fluxo pode ser usado para classificar as células individuais, mas este método requer o conhecimento de marcadores celulares específicos e equipamentos caros. 18 microdissecção de captura a laser ou com sistemas de laser UV ou IR microdissecção de captura permitem única célula e até mesmo a captura subcelulares, mas requer células de interesse para estar localizados na superfície de seções muito finas. 19 Semelhante a citometria de fluxo, laser microdissecção de captura também exige equipamentos caros. Um dos principais benefícios da técnica de coleta de eletrodo baseado descrito acima é que valiosos dados eletrofisiológicos pode ser obtido a partir da célula de interesse antes da colheita, permitindo a análise funcional e transcriptoma a ser realizada na mesma célula. 20 A desvantagem da nossa técnica é que exige experiência com micromanipuladores. Investigadores familiarizados com micromanipuladores encontrará esta técnica muito intuitiva, no entanto, os indivíduos com tal experiência será necessário tornar-se confortável com os movimentos bem necessário. Inerentes a qualquer técnica de amplificação é a amplificação preferencial de certas transcrições com base no tamanho e na composição de nucleotídeos. 4,6,7 reação em cadeia da polimerase (PCR), tais como técnicas baseadas transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e amplificação rápida de cDNA termina resultado (RACE) na amplificação exponencial de transcrições, enquanto que o procedimento de amplificação ARNA resultados na amplificação linear. Assim, uma das principais vantagens do procedimento ARNA reside na sua capacidade de preservar melhor a abundância relativa de transcritos mRNA por apenas linearmente ampliando quaisquer erros ou desvios que ocorrem no processo de amplificação em oposição a amplificar exponencialmente disse erros e distorções. O procedimento ARNA juntamente com a análise de microarray permite a comparação da abundância de mRNA entre as células individuais da morfologia semelhantes ou diferentes, tratada ou não. Além disso, material amplificado podem ser enviadas para o seqüenciamento da próxima geração. 5,8 No entanto, o cuidado deve ser tomado em tais análises, pois, em contraste com o uso de primers aleatórios para o procedimento, o procedimento de oligo-dT preparado descrito acima preconceitos amplificação do 3 &#39;extremidades do mRNA e geralmente resulta em redução ligeira de material amplificado subseqüente a cada rodada. Cuidados devem ser tomados na análise dos resultados microarray com métodos padrão como algumas chamadas falsas ausentes podem surgir a partir ligeiramente encurtado material amplificado. Além disso, os resultados enquanto o seqüenciamento vai realmente proporcionar a plena 5 &#39;seqüência da maioria dos mRNA original, a 5&#39; seqüências de alguns mRNA pode ser desperdiçada. Por estas razões, o número de rodadas de amplificações devem ser limitados.

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Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Spiegelgas coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological</td>
<td>63-3029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nunc 35x10 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-90</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water for cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-724Q</td>
<td>For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>6407</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>354239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Boric acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B0252</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and glutamax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41090-101</td>
<td>For plating cells</td>
</tr>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horse serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C1768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095-098</td>
<td>For growing cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 serum-free supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimble Chase</td>
<td>34500 99</td>
<td>Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. </td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175</td>
<td>Any solution will work as long as the components won&#x2019;t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)</td>
</tr>
<tr>
<td>1ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309628</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gauge depends on the diameter of the pipettes</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>28-4065-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dt-T7 oligo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom</td>
<td>Midland Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Second strand buffer (5x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Y01129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supplied with second strand buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>E.coli DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100002324</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA polymerase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004926</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnase H</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18021-071</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Megascript T7 kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Random primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BMB</td>
<td>11034731001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>56575</td>
<td>in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT</td>
</tr>
<tr>
<td>MEGAclear Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>1908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28206</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004994</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnasin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N251B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AMIL1791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-87</td>
<td>Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipette Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>MP-S15A</td>
<td>Will vary with micromanipulator and pipette O.D.</td>
</tr>
<tr>
<td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>5067-1511</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transcriptome analysis of single cells

Muitas técnicas de análise de expressão gênica confiar no material isolado de populações heterogêneas de células de homogeneizados de tecidos ou células em cultura. 1,2,3 No caso do cérebro, regiões, tais como o hipocampo contém um arranjo complexo de diferentes tipos de células, cada uma com distintos perfis de mRNA. A capacidade de colheita de células individuais permite uma maior investigação detalhada sobre as diferenças molecular entre e dentro de populações de células. Nós descrevemos um método simples e rápido para a colheita de células para posterior processamento. Pipetas muitas vezes utilizados em eletrofisiologia são utilizados para isolar (por meio de aspiração) uma célula de interesse e convenientemente depositá-lo em um tubo Eppendorf para posterior processamento com qualquer número de técnicas de biologia molecular. Nosso protocolo pode ser modificada para a safra de dendrites de cultura de células ou até células individuais de fatias aguda. Descrevemos também o método de amplificação ARNA como uma das principais aplicações a jusante de isolamentos única célula. Este método foi desenvolvido anteriormente por nosso laboratório como uma alternativa a outras técnicas de expressão de genes de análise, como transcrição reversa em tempo real ou reação em cadeia da polimerase (PCR). 4,5,6,7,8 Esta técnica prevê ampliação linear do RNA polyadenylated começando com femtogramas só de material, resultando em quantidades micrograma de RNA antisense. O material amplificado linearmente fornece uma estimativa mais precisa do que a amplificação exponencial da abundância relativa dos componentes do transcriptoma da célula isolada. O procedimento básico consiste em dois rounds de amplificação. Resumidamente, a T7 RNA polimerase promotor local é incorporada dupla cDNA encalhado criado a partir de transcritos no mRNA. Uma noite de transcrição in vitro de reação (FPI) é então feita em que T7 RNA polimerase produz muitas transcrições antisense do cDNA dupla fita. A segunda rodada repete este processo, mas com algumas diferenças técnicas desde a matéria-prima é antisense RNA. É padrão para repetir o segundo turno, resultando em três rounds de amplificação. Muitas vezes, a terceira rodada in vitro a reação de transcrição é realizada utilizando-nucleosídeos trifosfatos biotinilado para que o RNA antisense produzido pode ser cruzados e detectado em um microarray. 7,8

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Transcriptome Analysis of Single Cells

Neste artigo descrevemos um método simples para a colheita de células isoladas de ratos culturas primárias neuronais e análise de transcriptoma subsequentes usando a amplificação ARNA. Esta abordagem é generalizável a qualquer tipo de célula.

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Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Análise de células do sistema imunológico em único nervos ciático e gânglio da raiz Dorsal de um único rato usando citometria de fluxo

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Análise da localização de snRNA Spliceosomal em células HeLa humanas usando microinjeção

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Um modelo escalável para estudar os efeitos da lesão por força bruta em zebrafish adulto

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...