Name: transcriptome analysis of single cells
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00
Duration: 7 min 27 s
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Gracias a Kevin Miyashiro para la siembra y mantenimiento de cultivos de células, a la Dra. Terri Schochet para proporcionar cultivos de células de las imágenes incluidas en este documento. Además, gracias a Kevin Miyashiro, el Dr. Peter Buckley, y Pertiz Tiina para la entrada en el procedimiento de ARNA. La financiación de este trabajo fue del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento, el Instituto Nacional de Salud Mental y los recursos humanos fondos Buscador de Hecho de la Comunidad de Pennsylvania.

<ol>
	<li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury.">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li><li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+biology.">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li><li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1:+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity.">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li><li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology.">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li><li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis:+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders.">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li><li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+synthesis+in+situ:+methods+and+applications.">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li><li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li><li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration.">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-1000 &#38; P-97 Pipette Cookbook. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , 28-29 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Megascript kit. , 7-8 .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MEGAclear kit. , 4-5 .</li><li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells.">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li><li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis:+Implications+for+neuronal+functioning.">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li><li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype.">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li><li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis:+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+(PREXCEL-Q).">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li><li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li><li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy.">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li></ol>

Dr. Eberwine es un inventor de la patente ARNA que se ha autorizado a las tecnologías de LBS en la cual el Dr. Eberwine es un accionista.

Notas y solución de problemas <ul><li> Es posible que desee tomar antes y después de las imágenes que muestran que la célula diana fue aislado y que la penumbra restante fue dejado intacto. </li><li> Si demasiada solución es entrar en la pipeta a medida que se cosecha, se puede utilizar de 3 vías Luer-Lock accesorios y el émbolo de la jeringa para mantener la presión positiva en la tubería. El volumen deseado varía con el tipo de procesamiento, sino hasta 5 l es suficiente para la mayoría de las aplicaciones. </li></ul> Consejos generales sobre técnicas de biología molecular <ul><li> Vortex los tubos de valores y el giro hacia abajo antes de añadir a una reacción. NUNCA enzimas vórtice. </li><li> Mezclar bien las reacciones antes de añadir la enzima para asegurar que el buffer está en la concentración adecuada. </li><li> Mantener las poblaciones de la enzima a -20 ° C, si es posible mediante el uso de un stratacooler. De lo contrario, eliminar el derecho antes de su uso, mantener en hielo, y regresar de inmediato a -20 ° C. </li><li> Siempre hacen mezclas maestras en la preparación de más de una reacción para reducir los errores de pipeteo. Calcular el volumen requerido en función del número de muestras y añadir un 10-20%. </li><li> Tienda de ARN a -80 ° C a la degradación de retraso. El ARN es más estable almacenada en el búfer de apurination retraso de ARN que se produce en condiciones ácidas. </li></ul> Esquema general del procedimiento de ARNA Figura 4 ilustra la primera ronda del procedimiento de ARNA. En la reacción de la primera cadena, la parte de poli-T de la T7-oligo (dT) primer selecciona para las especies de ARNm (rectángulo blanco de largo) al unirse a la cola de poliA. Algunos microARN también poliadenilado y serán capturadas por este procedimiento. Más importante, sin embargo, el ARN más abundante en la célula, ARN ribosomal, no lo hará. Este oligo actúa como un manual para la transcriptasa reversa para sintetizar una hebra complementaria de cDNA (rectángulo gris de largo) utilizando el ARNm como molde. La parte de la T7 T7-oligo (dT) primer incorpora el promotor T7 RNA polimerasa en el marco con la secuencia antisentido al ARNm de partida. Esto se utiliza posteriormente en la reacción de transcripción in vitro en. A continuación, el ARNm en el híbrido de mRNA / ADN creado en el paso anterior es parcialmente hidrolizada por la RNasa H crear ARN &quot;primers&quot; (pequeños rectángulos de color blanco) similares a los fragmentos de Okazaki creado en la síntesis quedando la cadena de ADN. ADN polimerasa I utiliza los fragmentos de ARN para la síntesis del ADN con el ADN complementario al ARNm como molde. Cuando se llega al siguiente fragmento de ARN, el 5 &#39;a 3&#39; nucleasa elimina los ribonucleótidos y las reemplaza con desoxirribonucleótidos. ADN ligasa se añade a ligar los hilos en la sustitución de la principal línea no está completa. T4 DNA polimerasa se añade a rellenar las áreas donde los fragmentos de ARN sirve como cebadores inicial de la ADN polimerasa I la creación de un extremo romo de doble hebra de ADNc que se purifica antes de realizar la reacción de IVT. En la reacción de IVT, T7 ARN polimerasa se une al promotor T7 incorporado en las moléculas de ADNc de doble cadena y sintetiza el ARN antisentido (largo rectángulos negro) con la cadena de sentido como una plantilla. Esto sirve como el paso de amplificación en la que miles de moléculas de ARN antisentido se producen por cada molécula de doble hebra de ADNc (Figura 4). La segunda ronda, como se muestra en la Figura 4B, se inicia con una reacción de transcripción inversa que es ligeramente diferente de la de la primera ronda ya que el ARN antisentido de partida es (rectángulo negro sólido) y carece de la cola poliadenilado que fue objeto de la T7-oligo (dT) primer en la primera ronda. Por lo tanto, esta reacción se ceba con cebadores aleatorios (pequeños rectángulos grises) y posteriormente la desnaturalización del ARN. La reacción del segundo elemento es entonces preparado por la T7-oligo (dT) primer, que se une a la secuencia de poli-A en el extremo 3 &#39;del ARN sentido creado en la reacción de transcripción inversa anterior. Otra reacción IVT se realiza en la misma forma que en la primera ronda. Esta segunda ronda se suele repetir al menos una vez para lograr tres rondas de amplificación de una sola célula. Aplicaciones Las técnicas que hemos presentado en este artículo se puede traducir en un gran número de aplicaciones. El protocolo de una sola celda de aislamiento puede ser modificado para su uso en rodajas aguda. 14 Aunque técnicamente más difícil, los mismos principios se aplican en esta preparación alternativa. Además, si el tamaño de la pipeta es un poco ajustado, las grabaciones de la fisiología de las células se pueden hacer antes de la cosecha teniendo en cuenta una investigación bien controlada de los mecanismos moleculares que subyacen a los productos fisiológicos. Otra pequeña modificación consiste en aislar los procesos, desde el soma celular. 15 Para esta aplicación, recoger los cuerpos de células con una pipeta y luego volver con una pipeta nueva y recoger 100-300 Dendrit identificadoes o axones por tubo de recolección. 16 Una vez que las células se han obtenido, la comparación de la abundancia de ARNm y las composiciones se pueden hacer entre diferentes e incluso dentro de las poblaciones de la misma célula. La incorporación de biotina-UTP en el ARNA tercera ronda permite el análisis de microarrays para determinar las abundancias relativas de ARNm. La composición de la población de ARNm original también se puede determinar después de la intervención ARNA utilizando secuenciación de próxima generación. El ARNA amplificada también se puede utilizar para confirmar la célula estudios de conversión fenotipo en el que se transfectaron un conjunto completo de los ARNm de un tipo de células en un tipo celular diferente con el fin de inducir la transición del fenotipo del tipo de célula en que esta última de la primera, un procedimiento desarrollado por el laboratorio y se conoce como TIPeR 17. Estos estudios son particularmente útiles para el estudio de los estados de enfermedad y de fenotipos de células y estos estudios están actualmente en curso en el laboratorio. RT-PCR o PCR cuantitativa se puede realizar en el material amplificado para confirmar la expresión de genes específicos de la célula. Además, las evaluaciones de la eficacia de transfección o transducción se pueden hacer en el nivel de células individuales. Ventajas y limitaciones Como se indica en el resumen, el aislamiento de células individuales para el análisis elimina los efectos observados con un promedio de análisis de poblaciones celulares heterogéneas. Estos efectos promedio de tergiversar la abundancia de ARNm en una sola célula por la sobre-representación de abundantes transcripciones y media de la prevención y la detección de muchos de baja abundancia transcripciones. La citometría de flujo se puede utilizar para clasificar las células individuales, pero este método requiere el conocimiento de marcadores de células específicas y equipos costosos. 18 microdisección de captura por láser o bien con UV o IR sistemas láser captura microdissection permiten célula e incluso capturar subcelular, pero requiere que las células de su interés se encuentra en la superficie de secciones muy finas. 19 Al igual que la citometría de flujo, microdisección láser de captura también se requiere un equipo caro. Una de las principales ventajas de la técnica de electrodos colección basada descrito anteriormente es que los valiosos datos electrofisiológicos se puede obtener de la célula de interés antes de la cosecha, lo que permite el análisis funcional y transcriptoma para llevar a cabo en la misma celda. 20 Un aspecto negativo de nuestra técnica es que requiere experiencia en el uso micromanipulador. Los investigadores familiarizados con micromanipulador se encuentra esta técnica muy intuitiva, sin embargo, las personas con ninguna experiencia tendrá que sentirse cómodo con los movimientos finos necesarios. Inherentes a cualquier técnica de amplificación es la amplificación preferencial de las transcripciones de algunas basadas en el tamaño y la composición de nucleótidos. 4,6,7 reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada, como la reacción de transcripción inversa en cadena de polimerasa (RT-PCR) y la rápida amplificación de cDNA extremos (RACE) resultado en la amplificación exponencial de las transcripciones, mientras que el ARNA los resultados del procedimiento de amplificación de amplificación lineal. Así, una de las principales ventajas del procedimiento de ARNA reside en su capacidad para conservar mejor la abundancia relativa de las transcripciones de ARNm por sólo linealmente amplificando los errores o sesgos que se producen en el proceso de amplificación en lugar de amplificar de manera exponencial, dijo errores y sesgos. El procedimiento ARNA junto con el análisis de microarrays permite la comparación de las abundancias de mRNA entre las células individuales de morfología similar o diferente, tratados o sin tratar. Además, el material amplificado puede ser presentado para la secuenciación de próxima generación. 5,8 Sin embargo, se debe tener cuidado en este tipo de análisis, ya que, en contraste con el uso de cebadores aleatorios para el procedimiento, el procedimiento de oligo-dT cebado descrito anteriormente amplificación de los sesgos de la 3 &#39;de los ARNm y por lo general resulta en un acortamiento leve de material posterior amplifica con cada ronda. Se debe tener cuidado en el análisis de los resultados de microarrays con los métodos estándar como algunas llamadas ausente falsos pueden surgir a partir de material acorta ligeramente amplificado. Además, los resultados, mientras que la secuenciación hecho, proporcionará la completa secuencia 5 &#39;de la mayoría de los ARNm original, las secuencias 5&#39; de algunos ARNm podría pasarse por alto. Por estas razones, el número de rondas de amplificación debe ser limitado.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Spiegelgas coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological</td>
<td>63-3029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nunc 35x10 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-90</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water for cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-724Q</td>
<td>For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>6407</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>354239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Boric acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B0252</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and glutamax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41090-101</td>
<td>For plating cells</td>
</tr>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horse serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C1768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095-098</td>
<td>For growing cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 serum-free supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimble Chase</td>
<td>34500 99</td>
<td>Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. </td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175</td>
<td>Any solution will work as long as the components won&#x2019;t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)</td>
</tr>
<tr>
<td>1ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309628</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gauge depends on the diameter of the pipettes</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>28-4065-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dt-T7 oligo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom</td>
<td>Midland Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Second strand buffer (5x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Y01129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supplied with second strand buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>E.coli DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100002324</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA polymerase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004926</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnase H</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18021-071</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Megascript T7 kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Random primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BMB</td>
<td>11034731001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>56575</td>
<td>in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT</td>
</tr>
<tr>
<td>MEGAclear Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>1908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28206</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004994</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnasin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N251B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AMIL1791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-87</td>
<td>Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipette Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>MP-S15A</td>
<td>Will vary with micromanipulator and pipette O.D.</td>
</tr>
<tr>
<td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>5067-1511</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transcriptome analysis of single cells

Muchas técnicas de análisis de expresión génica se basan en elementos aislados de poblaciones heterogéneas de células de tejido homogeneizado o células en cultivo. 1,2,3 En el caso del cerebro, en regiones como el hipocampo contienen una compleja disposición de los diferentes tipos de células, cada una con distintos perfiles de ARNm. La habilidad de cosechar las células individuales permite una investigación más profunda en las diferencias moleculares entre y dentro de las poblaciones de células. Se describe un método sencillo y rápido para la obtención de células para su posterior procesamiento. Pipetas de uso frecuente en electrofisiología se utilizan para aislar (con aspiración) una célula de interés y conveniente depositarlo en un tubo Eppendorf para su posterior procesamiento con cualquier número de técnicas de biología molecular. El protocolo puede ser modificada para la cosecha de las dendritas de cultivo de células o celdas individuales de rebanadas aguda. También describe el método de amplificación ARNA como una de las principales aplicaciones aguas abajo de los aislamientos de células individuales. Este método fue desarrollado previamente por nuestro laboratorio como una alternativa a otras técnicas de análisis de expresión génica como la transcripción inversa o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 4,5,6,7,8 Esta técnica permite la amplificación lineal de la poliadenilado ARN a partir de femtogramos sólo de materiales y que resulta en cantidades de microgramos de ARN antisentido. El material linealmente amplificado proporciona una estimación más precisa de la amplificación por PCR exponencial de la abundancia relativa de los componentes del transcriptoma de la celda de aislamiento. El procedimiento básico consiste en dos rondas de amplificación. En pocas palabras, un sitio de la RNA polimerasa T7 promotor se incorpora a doble varados cDNA creado a partir de las transcripciones de ARNm. Una noche a la mañana en la transcripción in vitro (FIV) la reacción se realiza a continuación en el que la RNA polimerasa T7 produce muchas transcripciones antisentido del cDNA de doble cadena. La segunda ronda se repite este proceso, pero con algunas diferencias técnicas, ya que el material de partida es el ARN antisentido. Es un estándar para repetir la segunda vuelta, resultando en tres rondas de amplificación. A menudo, la tercera ronda en la reacción de transcripción in vitro se realiza con los trifosfatos nucleósidos con biotina para que el ARN antisentido producido puede ser híbridas, y detectado en un microarray de 7,8.

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Transcriptome Analysis of Single Cells

En este artículo se describe un método simple para la recolección de las células individuales de rata cultivos primarios de neuronas y posterior análisis de transcriptoma utilizando la amplificación ARNA. Este enfoque es generalizable a cualquier tipo de célula.

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Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Asomándose al cerebro Polisomas con microscopía de fuerza atómica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Análisis de las células inmunes en solo de los nervios ciático y de ganglio de raíz Dorsal de un ratón mediante citometría de flujo

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Análisis de la localización de ARNS spliceosomal en células hela humanas con microinyección

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Un modelo escalable para estudiar los efectos de la lesión por fuerza contundente en peces cebra adultos

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...