Name: transcriptome analysis of single cells
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome Analysis of Single Cells at JoVE.com

Tack till Kevin Miyashiro för plätering och underhålla cellkulturer, till Dr Terri Schochet för att tillhandahålla cellkulturer för de bilder som ingår i detta dokument. Dessutom, tack till Kevin Miyashiro, Dr Peter Buckley, och Tiina Pertiz för inmatning på ARNA förfarande. Finansieringen av detta arbete var från National Institute on Aging, National Institute för psykisk hälsa och Human Resources Fakta medel Finder från Commonwealth of Pennsylvania.

<ol>
	<li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury.">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li><li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+biology.">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li><li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1:+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity.">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li><li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology.">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li><li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis:+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders.">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li><li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+synthesis+in+situ:+methods+and+applications.">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li><li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li><li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration.">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-1000 &#38; P-97 Pipette Cookbook. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , 28-29 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Megascript kit. , 7-8 .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MEGAclear kit. , 4-5 .</li><li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells.">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li><li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis:+Implications+for+neuronal+functioning.">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li><li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype.">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li><li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis:+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+(PREXCEL-Q).">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li><li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li><li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy.">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li></ol>

Dr Eberwine är en uppfinnare på ARNA patent som har licensierats till LBS teknik, där Dr Eberwine är en aktieägare.

Anteckningar och felsökning <ul><li> Du kanske vill ta före och efter bilder som visar att målcellen var isolerat och att resterande Penumbra lämnades orörd. </li><li> Om för mycket vätska kommer in i pipetten som du är skörd, kan du använda 3-vägs Luer-Lock kopplingar och kolven till sprutan för att hålla övertryck i slangen. Önskad volym varierar med typ av behandling, men upp till 5 l ska vara bra för de flesta tillämpningar. </li></ul> Allmänna tips om molekylärbiologiska tekniker <ul><li> Vortex alla djur rör och spinn ner dem innan du lägger till en reaktion. ALDRIG virvel enzymer. </li><li> Blanda reaktioner innan du lägger det enzym för att säkerställa att bufferten är i rätt koncentration. </li><li> Håll enzym lager vid -20 ° C om möjligt med hjälp av en stratacooler. Annars ta höger före användning, hålla på is, och omedelbart återvända till -20 ° C. </li><li> Gör alltid huvudmixar när de upprättat mer än en reaktion för att minska pipettering fel. Beräkna volymen som behövs baserat på det antal prover och lägga till 10-20%. </li><li> Förvara RNA vid -80 ° C till fördröja nedbrytning. RNA är mest stabila lagras i bufferten för att fördröja apurination av RNA som sker i sur miljö. </li></ul> Allmän beskrivning av ARNA arbetsordningen Figur 4A visar den första rundan av ARNA förfarande. I den första delen reaktionen väljer poly-T delen av T7-oligo (DT) primer för mRNA-arter (långa vita rektangeln) genom att binda till Polya svansar. Vissa mikroRNA också polyadenylated och kommer att fångas av detta förfarande. Ännu viktigare är dock den vanligast förekommande RNA i cellen, ribosomala RNA, kommer inte. Detta oligo fungerar som en primer för omvänt transkriptas att syntetisera en kompletterande delen av cDNA (lång grå rektangel) med mRNA som mall. Den T7 delen av T7-oligo (DT) primer innefattar T7 RNA-polymeras promotor i ramen med sekvensen antisense till start mRNA. Detta används senare i in vitro transkription reaktion. Därefter är det mRNA i mRNA / DNA-hybrid skapade i föregående steg delvis hydrolyserad genom RNase H skapa RNA &quot;primer&quot; (små vita rektanglar) liknande den Okazaki fragment som skapas i eftersläpande del DNA-syntesen. DNA-polymeras Jag använder RNA-fragment till bästa DNA-syntesen genom att använda DNA komplement till mRNA som mall. När den når nästa RNA fragmentet, dess 5 &#39;till 3&#39; nukleas aktivitet tar bort ribonucleotides och ersätter dem med deoxyribonucleotides. DNA-ligas läggs till ligate några trådar där utbyte av de ledande tråd är inte komplett. T4 DNA-polymeras tillsätts för att fylla i de områden där RNA-fragment tjänade som första primer till DNA-polymeras jag skapar en trubbig slutade dubbelsträngad cDNA som sedan renas innan du utför IVT reaktion. I IVT reaktion binder T7 RNA-polymeras till T7 promotorn införlivas i dubbelsträngad cDNA och syntetiserar antisense-RNA-molekyler (långa svarta rektanglar) med hjälp av sense-strängen som mall. Detta fungerar som amplifieringssteg där tusentals antisense-RNA-molekyler produceras från varje dubbelsträngad cDNA molekyl (Figur 4A). Den andra omgången, som avbildas i figur 4B, börjar med en omvänd transkription reaktion som skiljer sig något från den första omgången eftersom grundbeloppet RNA antisense (solid svart rektangel) och saknar polyadenylated svansen som var målgruppen för T7-oligo (DT) primer i första omgången. Därför är denna reaktion primas med slumpmässiga primers (små grå rektanglar) och RNA senare denatureras. Den andra delen reaktionen sedan grundmålas med T7-oligo (DT) primer, som binder till poly-En sekvens på 3 &quot;i slutet av den meningen RNA som skapats i föregående omvänd transkription reaktion. En annan IVT Reaktionen utförs på samma sätt som i den första omgången. Denna andra runda är oftast upprepas minst en gång för att uppnå tre rundor av förstärkning från en enda cell. Applikationer De tekniker som vi har presenteras i denna artikel kan översättas till ett stort antal ansökningar. Den enda cell isolering protokoll kan modifieras för att användas i akuta skivor. 14 Även tekniskt mer utmanande, samma principer gäller i den här alternativa beredning. Dessutom, om storleken på pipetten är något justerad, kan inspelningar av fysiologi cellerna göras innan skörden möjliggör en väl kontrollerad undersökning av molekylära mekanismerna bakom fysiologiska utgångar. En annan liten ändring är att isolera processer från cellen soma. 15 För denna tillämpning samla cell kroppar med en pipett och sedan gå tillbaka med en fräsch pipett och samla 100-300 identifierade dendrites eller axoner per provröret. 16 När cellerna har skördats, jämförelser av mRNA abundances och kompositioner kan göras mellan olika och även inom samma cell populationer. Införliva biotinylerad-UTP i den tredje omgången ARNA möjliggör microarray analys för att fastställa dessa relativa mRNA abundances. Sammansättningen av den ursprungliga mRNA befolkningen kan också bestämmas efter ARNA proceduren med nästa generations sekvensering. Det förstärkta ARNA kan också användas för att bekräfta cellförsök fenotyp omvandling där en fullständig uppsättning mRNA från en cell typ transfekterade till en annan celltyp i syfte att förmå övergång fenotyp av den senare celltyp liksom i den förra, ett förfarande som utvecklats av labbet och kallas TIPeR. 17 Dessa studier är särskilt användbara för att studera sjukdomen stater och fenotyper cell och sådana studier pågår för närvarande i labbet. RT-PCR eller realtids-PCR kan utföras på det förstärkta materialet för att bekräfta ett uttryck för cell-specifika gener. Dessutom kan utvärderingar av effektiviteten i transfektion eller transduktion göras på enskild cellnivå. Fördelar och begränsningar Som framgår av abstrakt, eliminerar isolering av enskilda celler för analys i genomsnitt effekter setts med analys av heterogena cellpopulationer. Dessa genomsnitt effekter förvränga mRNA abundances i en enda cell med över-som representerar rikligt avskrifter och i genomsnitt ut och förhindra upptäckt av många låg-överflöd avskrifter. Flödescytometri kan användas för att sortera enskilda celler, men denna metod kräver kunskap om cellens specifika markörer och dyr utrustning. 18 Laser fånga microdissection antingen med UV-eller IR laser fånga microdissection system möjliggör enskild cell och även subcellulära fånga men kräver celler av intresse för placeras på ytan av mycket tunna sektioner. 19 Liknande flödescytometri kräver laser fånga microdissection också dyr utrustning. En av de stora fördelarna med elektroden baserade samlingen teknik som beskrivs ovan är att värdefull elektrofysiologiska data kan erhållas från cellen av intresse före skörd, vilket möjliggör funktionell och transkriptom analys som ska utföras på en och samma cell. 20 En nackdel med vår teknik är att det kräver erfarenhet av att använda micromanipulators. Utredarna känner micromanipulators finner denna teknik mycket intuitivt, men kommer personer utan sådan erfarenhet måste bli bekväm med erforderlig fina rörelser. Naturlig del av varje förstärkningsteknik skall förmånssystemet förstärkning av vissa avskrifter baserade på storlek och nukleotid sammansättning. 4,6,7 polymeraskedjereaktion (PCR) tekniker som omvänd transkription polymeraskedjereaktion (RT-PCR) och snabb förstärkning av cDNA ändar (RACE) resultera i exponentiell amplifiering av avskrifter, medan ARNA amplifieringsförfarande resulterar i linjär förstärkning. Således ligger en av de stora fördelarna med ARNA förfarandet i sin förmåga att bättre bevara den relativa förekomsten av mRNA transkript med endast linjärt förstärka eventuella fel eller fördomar som inträffar i amplifieringsprocessen i motsats till exponentiellt förstärka sa fel och fördomar. Det ARNA förfarande i kombination med microarray analys möjliggör jämförelser av mRNA abundances mellan enskilda celler av liknande eller olika morfologi, behandlade eller obehandlade. Dessutom kan förstärkas material lämnas för nästa generations sekvensering. 5,8 bör dock vara försiktig i sådana analyser sedan, i motsats till användningen av slumpmässiga grundfärg för förfarande, oligo-dT primas förfarande som beskrivs ovan fördomar amplifiering av 3 &#39;änden av mRNA och leder i allmänhet liten förkortning av efterföljande förstärkt material med varje runda. Försiktighet bör iakttas vid analys av microarray resultat med standardiserade metoder som några falska frånvarande samtal kan uppstå kortas något förstärkt material. Dessutom kommer samtidigt sekvensering resultat att ge de fulla 5 &quot;sekvens av de flesta av de ursprungliga mRNA, den 5&quot; kan sekvenser av vissa mRNA missas. Av dessa skäl bör antalet omgångar av kompletteringar vara begränsad.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Spiegelgas coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological</td>
<td>63-3029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nunc 35x10 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-90</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water for cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-724Q</td>
<td>For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>6407</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>354239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Boric acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B0252</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and glutamax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41090-101</td>
<td>For plating cells</td>
</tr>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horse serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C1768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095-098</td>
<td>For growing cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 serum-free supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimble Chase</td>
<td>34500 99</td>
<td>Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. </td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175</td>
<td>Any solution will work as long as the components won&#x2019;t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)</td>
</tr>
<tr>
<td>1ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309628</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gauge depends on the diameter of the pipettes</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>28-4065-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dt-T7 oligo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom</td>
<td>Midland Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Second strand buffer (5x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Y01129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supplied with second strand buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>E.coli DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100002324</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA polymerase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004926</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnase H</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18021-071</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Megascript T7 kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Random primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BMB</td>
<td>11034731001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>56575</td>
<td>in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT</td>
</tr>
<tr>
<td>MEGAclear Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>1908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28206</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004994</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnasin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N251B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AMIL1791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-87</td>
<td>Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipette Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>MP-S15A</td>
<td>Will vary with micromanipulator and pipette O.D.</td>
</tr>
<tr>
<td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>5067-1511</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transcriptome analysis of single cells

Många genuttrycksanalys tekniker förlitar sig på material som isoleras från heterogena populationer av celler från vävnader homogenat eller celler i kultur. 1,2,3 Vid hjärnan, regioner, såsom hippocampus innehåller ett komplext arrangemang av olika celltyper, alla med distinkta mRNA profiler. Förmågan att skörda enskilda celler möjliggör en mer djupgående undersökning av de molekylära skillnaderna mellan och inom cellpopulationer. Vi beskriver en enkel och snabb metod för att skörda celler för vidare bearbetning. Pipetter som ofta används i elektrofysiologi används för att isolera (med aspiration) en cell av intresse och bekvämt sätta in den i ett Eppendorf-rör för ytterligare behandling med valfritt antal av molekylärbiologisk teknik. Våra protokoll kan modifieras för skörd av dendriter från cell kultur eller till och med enskilda celler från akut skivor. Vi beskriver också den ARNA förstärkning metoden som en stor nedströms tillämpning av en enda cell isolering. Denna metod har utvecklats tidigare av vårt labb som ett alternativ till andra analyser genuttryck tekniker som omvänd transkription eller realtid polymeraskedjereaktion (PCR). 4,5,6,7,8 Denna teknik ger linjär amplifiering av polyadenylated RNA börjar med bara femtograms av material och resulterar i mikrogram mängder av antisense-RNA. Den linjärt förstärks materialet ger en mer exakt bedömning än PCR-exponentiell amplifiering av den relativa förekomsten av komponenter i transkriptom av de isolerade cell. Den grundläggande proceduren består av två rundor av förstärkning. Kortfattat är en T7 RNA-polymeras promotor sajt införlivas dubbelsträngad cDNA skapas från mRNA transkript. En övernattning för in vitro transkription (IVT) reaktion utförs därefter som T7 RNA-polymeras producerar många antisense avskrifter från strandade dubbla cDNA. Den andra omgången upprepar detta förlopp men med vissa tekniska skillnader eftersom utgångsmaterialet är antisense-RNA. Det är standard att upprepa den andra omgången, vilket resulterade i tre rundor av förstärkning. Ofta är den tredje rundan för in vitro transkription reaktion utförs med hjälp biotinylerad nukleosid trifosfater så att antisense-RNA produceras kan hybridiseras och upptäcks på en microarray. 7,8

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome Analysis of Single Cells at JoVE.com

Transcriptome Analysis of Single Cells

I denna artikel beskriver vi en enkel metod för skörd av enstaka celler från råtta primära neuronala kulturer och efterföljande transkriptom analys med ARNA förstärkning. Detta tillvägagångssätt är generaliserbara till alla celltyper.

Transkriptom Analys av enskilda celler

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sekventiell fotoblekningsreaktion att avgränsa Single Schwann celler vid den neuromuskulära förbindelsen

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Märkning av enstaka celler i det centrala nervsystemet hos<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture mikrodissektion av berikade populationer av nervceller eller Single neuroner för genuttrycksanalys efter traumatisk hjärnskada

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering på Brain polysomer med atomkraftsmikroskopi

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

En-cell-RNA-Seq av definierade deluppsättningar av retinala Ganglion-celler

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analys av immunceller i enda höftnerver och dorsalrotsganglier Ganglion från ett enda musklick med hjälp av flödescytometri

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolering av vuxna ryggmärgen kärnor för massivt parallella singel-nucleus RNA-sekvensering

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Analys av Spliceosomal snRNA lokalisering i mänskliga hela celler med mikroinjektion

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

En skalbar modell för att studera effekterna av trubbig kraftskada hos vuxna zebrafiskar

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...