Name: fabrication of micropatterned hydrogels for neural culture systems using dynamic mask projection photolithography
Uploaded: 2011-02-11T23:00:00
Duration: 16 min 6 s
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लेखकों के लिए प्रो एंथोनी Windebank की प्रयोगशाला DRG विच्छेदन और संस्कृति पर उनकी विशेषज्ञता का साझा करने के लिए शुक्रिया अदा करना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से DMD सेटअप के बारे में उपयोगी विचार विमर्श के लिए प्रो Shaochen चेन. इस अनुसंधान में भाग Tulane विश्वविद्यालय और रीजेण्ट के लुइसियाना बोर्ड से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था (LEQSF [2009-10] - आरडी - ए 18) और NIH (NS065374).

<ol>
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G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture.">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li><li>Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+and+electrophysiology+of+neural+cell+structures+generated+by+the+inkjet+printing+method.">Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method.</a> Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).</li><li>Liu Tsang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+hepatic+tissues+by+additive+photopatterning+of+cellular+hydrogels.">Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels.</a> FASEB J. 21, 790-801 (2007).</li><li>Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+tectonics:+A+comprehensive+construction+platform+for+microfluidic+systems.">Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).</li><li>Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+micro-mirror+device-based+system+for+the+microfabrication+of+complex,+spatially+patterned+tissue+engineering+scaffolds.">A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).</li><li>Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+maskless+microscope+projection+photolithography+system+and+its+application+in+light-directed+fabrication+of+DNA+microarrays.">Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays.</a> Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

इस के साथ साथ वर्णित विधि किसी भी सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल संस्कृति प्रणालियों की मांग अन्वेषक द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है. सिद्धांततः, photopolymerizable उपलब्ध hydrogels के विस्तृत विविधता के कारण, पर्यावरण के लिए किसी भी सेल सहित पूरे ऊतक explants प्रकार, के साथ प्रयोग के लिए अनुमति देने के लिए सिलवाया किया जा सकता है. इसके अलावा, दोहरी hydrogel प्रणाली स्वयं polymerizing hydrogels, जो अपने दम पर अनाकार आकार के रूप में करते हैं की प्रस्तुति में सुधार स्थानिक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है. जिसके परिणामस्वरूप &quot;2.5D&quot; micropatterned hydrogel constructs तंत्रिका विकास के लिए एक 2d विन्यास है कि सक्षम बनाता है सुविधाजनक सूक्ष्म मूल्यांकन में प्रस्तुत एक 3 डी मैट्रिक्स प्रदान करते हैं. सब्सट्रेट जिस पर जैल polymerized हैं भी, विविध किया जा सकता है प्रयोगात्मक डिजाइन में अधिक से अधिक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है. हमारे तरीकों सेल संस्कृति पारगम्य समर्थन के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, के रूप में हम गिलास स्लाइड (नहीं दिखाया डेटा है) पर polymerization की तुलना में सुधार व्यवहार्यता (चित्रा 4) के रूप में देखा है. हालांकि, अन्य polymerization सतहों और विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है: कांच पर निर्माण स्लाइड microfluidics प्रयोगों या उदाहरण के लिए सेल कुल फार्मेशनों, में प्रयोग किया जाता है. इन संस्कृति प्रणालियों के साथ हमारा अनुभव कठिनाई के संभावित क्षेत्रों की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया गया है. सबसे पहले, सावधान तकनीक constructs के बाँझपन बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं. DMD सेटअप के भारी प्रकृति के कारण, यह मुश्किल है polymerization के चरणों बाँझ शर्तों के तहत संचालित है. इस मुद्दे का मुकाबला करने के लिए, कुल्ला तरीकों में वर्णित कदम मददगार है, और एंटीबायोटिक दवाओं सभी मीडिया में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, अंतिम मोटाई और polymerized निर्माण के आकार के अत्यधिक पूर्व बहुलक मिश्रण के तरल पदार्थ के व्यवहार पर निर्भर है, और एक meniscus के उपस्थिति जेल constructs कि बहुत पतले या अधूरे polymerized (चित्रा 6) में परिणाम कर सकते हैं. दो कदम सेल संस्कृति आवेषण के अंदर एक meniscus के गठन को कम करने के लिए लिया जा सकता है है. मोटी hydrogels (&gt; 200 सुक्ष्ममापी), डालने के अंदर दीवार के आसपास वर्षा एक्स के एक सरल कोटिंग पर्याप्त है. हालांकि, के रूप में संक्षेप में ऊपर पतली constructs (&lt;200 सुक्ष्ममापी) के लिए में वर्णित है, एक तेल की परत करने के लिए दोनों meniscus को कम करने और मुक्त कट्टरपंथी polymerization के ऑक्सीजन शमन नकारना की आवश्यकता है. संकल्प सुविधा आकार में कमी के साथ तेजी से मोटा जैल एहसास के साथ, मोटाई पर निर्भर हो पाया था. संकल्प भी पर निर्भर करता है कि सुविधा hydrogel में एक सकारात्मक या नकारात्मक राहत का प्रतिनिधित्व विविध. हालांकि, हम ~ 100 केवल माइक्रोस्कोप उद्देश्यों का उपयोग कर के रूप में प्रकाशिकी ध्यान केंद्रित सुक्ष्ममापी पैमाने पर न्यूनतम सुविधा आकार के साथ constructs के लिए पर्याप्त संकल्प हासिल की. हमारे प्रयोगों से पता चला है कि दोहरी hydrogel यहाँ वर्णित constructs neurite विकास और मार्गदर्शन के बुनियादी मॉडल में इन विट्रो के गठन के लिए एक उत्कृष्ट आधार का प्रतिनिधित्व करते हैं. micropatterning कार्यरत तकनीक मौजूदा 18,19 तरीकों की एक रूपांतर है, लेकिन हमारे सेट अप एक सरल डिजाइन को लागू करने के लिए पर बल दिया और सेल संस्कृति आवेषण पर दोहरी hydrogel constructs के उत्पादन के लिए अनुकूलित किया गया था, सेल संस्कृति आवेषण सेल व्यवहार्यता के रूप में अच्छी तरह से सुधार के लिए महत्वपूर्ण थे के रूप में पहले से पक्षपाती ऊतक explants आसपास crosslinking. दिखाए गए परिणामों के दायरे हमारी प्रयोगशाला के हितों के द्वारा सीमित है, तथापि, हम विश्वास है कि इस प्रकाशन में वर्णित विधि एक अपेक्षाकृत सस्ते, 3 डी सेल संस्कृति के निर्माण के लिए जल्दी और उपयोग करने के लिए आसान विधि के लिए खोज रहे शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी साबित होगा मॉडल.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Digital Micromirror Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Texas Instruments</td>
<td>DLPD4X00KIT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen Coated Transwell Permeable Support </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3491</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyester Transwell Permable Support</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3412</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-164</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nerve Growth Factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13257-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Puramatrix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEG 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>15178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Irgacure 2959</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>0298913AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Have used both canola oil and silicon oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation</td>
</tr>
<tr>
<td>OmniCure Series 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Exfo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication of micropatterned hydrogels for neural culture systems using dynamic mask projection photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

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Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Microfabricated तंत्रिका संस्कृति नियमित रूप से सेल संस्कृति substrates पर गतिशील मुखौटा प्रक्षेपण लिथोग्राफी के लिए एक डिजिटल micromirror उपकरण का उपयोग कर प्रणाली का तेजी से उत्पादन के लिए सरल तकनीक वर्णित हैं. ये संस्कृति प्रणालियों प्राकृतिक जैविक वास्तुकला का अधिक प्रतिनिधि हो सकता है और तकनीक वर्णित कई अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Micropatterned Hydrogels के तंत्रिका संस्कृति गतिशील मास्क प्रोजेक्शन Photolithography का उपयोग कर सिस्टम के लिए निर्माण कार्य

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

यंत्रवत् गतिशील सेल संस्कृति के लिए microfabricated प्लेटफार्म

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

और अंडाशय Oviducts के तीन आयामी अंग संस्कृति के लिए Alginate Hydrogels

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

मानव सेल संस्कृति घूर्णन सेल संस्कृति सिस्टम: एक मॉडल के रूप में मानव ट्रोफोब्लास्ट कक्ष

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

सेल सह संस्कृति जलीय दो चरण सिस्टम का उपयोग कर Patterning

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

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मापने के लिए लघु दोहरे तत्व तनाव gages के निर्माण और आरोपण<em&gt; इन विवो</em&gt; कृन्तकों में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल संकुचन.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिका प्रत्यारोपण के लिए micropatterned संस्कृति प्लेटों पर उपगोल प्रकोष्ठों की ओर जीन अभिकर्मक

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

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This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

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3 डी सेल संस्कृति के लिए पल्मोनरी बाह्य मैट्रिक्स से Tunable Hydrogels

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