Name: iclip - transcriptome-wide mapping of protein-rna interactions with individual nucleotide resolution
Uploaded: 2011-04-30T14:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution at JoVE.com

الكتاب أشكر جميع أعضاء المختبرات الندبة ، وLuscombe Zupan للمناقشة والمساعدة التجريبية. نشكر جيمس هادفيلد ونيك ماثيوز عن التسلسل الإنتاجية العالية. نود أن نشير إلى أن الأسلوب الموصوفة هنا iCLIP أسهم عدة خطوات مع بروتوكول CLIP الأصلي الذي وضعه جنسن كيرك وJU في مختبر روبرت دارنيل. وأيد هذا العمل عن طريق منح المجلس الأوروبي للبحوث 206726 - CLIP لJU والطويلة الأجل للعلوم الإنسان حدود الزمالة لبرنامج JK

<ol>
	<li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+regulons:+coordination+of+post-transcriptional+events.">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li><li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+regulation:+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code.">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> RNA. 14, 802-813 (2008).</li><li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+right+RNA:+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins.">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1071-1082 (1999).</li><li>Brooks, S. A., Rigby, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+mRNA+ligands+bound+by+the+RNA+binding+protein+hnRNP+A2+utilizing+a+novel+in+vivo+technique.">Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique.</a> Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).</li><li>Mili, S., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+reassociation+of+RNA-binding+proteins+after+cell+lysis:+implications+for+the+interpretation+of+immunoprecipitation+analyses.">Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses.</a> RNA. 10, 1692-1694 (2004).</li><li>Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302, 1212-1215 (2003).</li><li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+A+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells.">CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37, 376-386 (2005).</li><li>Licatalosi, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456, 464-469 (2008).</li><li>Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+code+for+the+FOX2+splicing+regulator+revealed+by+mapping+RNA-protein+interactions+in+stem+cells.">An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).</li><li>Urlaub, H., Hartmuth, K., L&#252;hrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-tracked+approach+to+analyze+RNA-protein+crosslinking+sites+in+native,+nonlabeled+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles.">A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Methods. 26, 170-181 (2002).</li><li>K&#246;nig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

منذ بروتوكول iCLIP يحتوي على مجموعة متنوعة من التفاعلات الإنزيمية والخطوات لتنقية ، فإنه ليس من السهل دائما تحديد المشكلة عند تجربة فشل. من أجل السيطرة على لخصوصية تحديد المواقع عبر الارتباط RNA ، ينبغي الحفاظ على واحد أو أكثر من عناصر التحكم في كافة مراحل التجربة السلبية الكاملة والتحليلات الحسابية لاحقا. يمكن أن تكون هذه الضوابط العينة عدم الأضداد ، والخلايا غير عبر ربط ، أو مناعي من الخلايا أو الأنسجة خروج المغلوب. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تحكم هذه التجارب لا تنقي أي مجمعات البروتين RNA ، وبالتالي ينبغي أن تعطي أي إشارة على جل SDS - PAGE ، وليس بعد اكتشاف منتجات التضخيم PCR. ينبغي عالية الإنتاجية تسلسل هذه المكتبات التحكم عودة تسلسل فريد قليلة جدا. لا ينصح الخلايا ضربة قاضية كعنصر تحكم التسلسل ، لأن تسلسل الناتجة تقابل ما زال عبر ربط مواقع من البروتين نفسه الذي تتم تنقيته من الخلايا ضربة قاضية بكميات أصغر. وينبغي أيضا الاحتياطات الواجب اتخاذها لتجنب تلوث المنتجات مع PCR من التجارب السابقة. أفضل وسيلة للحد من هذه المشكلة هو لفصل مكانيا الخطوات السابقة واللاحقة PCR. من الناحية المثالية ، ينبغي إجراء تحليل PCR المنتجات وجميع الخطوات اللاحقة في غرفة منفصلة. وعلاوة على ذلك ، يجب على كل عضو في المختبر استخدام الخاصة بها مجموعة من المخازن والكواشف الأخرى. في هذه الطريقة ، يمكن تحديد مصادر التلوث أسهل.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2638">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution</a>. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to: "...as well as 2 &#x03BC;l Turbo DNase..." instead of: "...as well as 2 ml Turbo DNase..."

A correction to the article iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution was made.

Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

للنقل الكهربائي للهلام وغشاء نوصي انه ر استخدام SureLock XCell ® مصغرة الخلية والثاني XCell ™ CE كيت وحدة لطخة مارك (Invitrogen ، EI0002) ، وهو متوافق مع استخدام minigels الجاهزة المختلفة التي تم تحديدها في جميع أنحاء بروتوكول . يذكر أن عدد العلامات التجارية والنظام لجميع المواد التي استخدمت خلال البروتوكول. يتم عرض قائمة من الإنزيمات المستخدمة في البروتوكول في الجدول أدناه. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج # </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> البروتين Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> استخدام الأجسام المضادة لبروتين G الماوس أو الماعز </td></tr><tr><td> أنا ريبونوكلياز </td><td> Ambion </td><td> AM2295 </td><td> يمكن أن تتغير من النشاط على دفعات </td></tr><tr><td> T4 RNA يغاز أنا </td><td> NEB </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> بروتين K </td><td> روش </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> ثالثا مرتفع عكس المنتسخة </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase الثاني </td><td> Epicentre </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ SuperMix أنا </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> هذا المزيج PCR يعطي أفضل النتائج في أيدينا </td></tr></table>

iclip - transcriptome-wide mapping of protein-rna interactions with individual nucleotide resolution

تركيبة فريدة والترتيب المكاني للRNA ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) على نسخة دليل الجوانب المتنوعة في مرحلة ما بعد النسخي البند 1. لذلك ، خطوة أساسية نحو تنظيم محضر التفاهم على المستوى الجزيئي هي لاكتساب المعلومات الموضعية على مواقع الربط من الممارسات التجارية التقييدية 2. ويمكن دراسة البروتينات والحمض النووي الريبي التفاعلات الكيميائية الحيوية باستخدام الأساليب ، ولكن هذه الطرق لا تتناول الحمض النووي الريبي ملزمة في سياقها الأصلي الخلوية. المحاولات الأولية لدراسة البروتينات والحمض النووي الريبي المجمعات في بيئتها الخلوية المستخدمة لتنقية تقارب أو مناعي جنبا إلى جنب مع الفرق عرض أو تحليل ميكروأري (RIP - CHIP) 3-5. وكانت هذه الأساليب عرضة لتحديد التفاعلات غير المباشرة أو غير الفسيولوجية - 6. يشار استراتيجية من أجل زيادة نوعية والقرار الموضعية ، على أنه قدم CLIP (الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط ومناعي) 7،8. CLIP يجمع عبر ربط الأشعة فوق البنفسجية من البروتينات وجزيئات الحمض النووي الريبي مع مخططات تنقية صارمة بما في ذلك تغيير طبيعة بولي أكريلاميد هلام إستشراد. بالاشتراك مع تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية ، وقد ثبت CLIP كأداة قوية لدراسة البروتينات والحمض النووي الريبي التفاعل على نطاق والجينوم واسعة (ويشار إلى CLIP - HITS CLIP أو بعدها) 9،10. مؤخرا ، تم إدخال PAR - CLIP يستخدم النظير لريبونوكليوزيد photoreactive عبر ربط 11،12. على الرغم من نوعية عالية من البيانات التي تم الحصول عليها ، والتجارب CLIP كثيرا ما تولد من التعقيد مكتبات [كدنا] تسلسل محدودة. هذا يرجع جزئيا إلى كمية محدودة من شارك في المنقى واثنين من الحمض النووي الريبي RNA ربط الكفاءة ردود الفعل المطلوبة لإعداد المكتبة. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت المقايسات تمديد التمهيدي cDNAs أن العديد من اقتطاع قبل الأوان بنسبة 13 في النوكليوتيدات crosslinked. يتم فقدان هذه cDNAs اقتطاع خلال بروتوكول CLIP معيار إعداد المكتبة. نحن وضعت مؤخرا iCLIP (فردية النوكليوتيدات CLIP القرار) ، والذي يجسد cDNAs اقتطاعها من خلال استبدال واحدة من الخطوات غير فعالة الربط بين الجزيئات RNA مع التعميم أكثر كفاءة ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ [كدنا] (الشكل 1) 14. الأهم من ذلك ، تسلسل cDNAs اقتطاع يقدم أفكارا في موقف للموقع عبر وصلة في القرار النوكليوتيدات. طبقنا بنجاح iCLIP لدراسة الجسيمات C hnRNP منظمة على نطاق واسع الجينوم وتقييم دورها في تنظيم الربط 14.

Watch this Scientific Journal Video about iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution at JoVE.com

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

الترتيب المكاني للRNA البروتينات ملزم على نص هو أحد المحددات الرئيسية لمرحلة ما بعد النسخي التنظيم. ولذلك ، قمنا بتطوير الفرد والأشعة فوق البنفسجية النوكليوتيدات يشابك القرار ومناعي (iCLIP) الذي يسمح دقيقة الجينوم على نطاق ورسم خرائط للمواقع الملزم للبروتين النووي الريبي ملزمة.

iCLIP -- Transcriptome على صعيد رسم الخرائط من البروتين RNA التفاعلات مع القرار الفردي النكليوتيد

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biology

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

غير الغازية مع التصور 3D - الفرعية ميكرون القرار باستخدام السنكروترون - X - أشعة التصوير المقطعي

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

متصور النسخة الدوبامين في محطات قبل المشبكي فردية مع FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR كليب -- وسيلة لتحديد نطاق Transcriptome مواقع الربط من البروتينات الحمض النووي الريبي تجليد

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

الكروماتين تحليل التفاعل مع تسلسل العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لرسم خرائط التفاعلات الكروماتين وفهم تنظيم النسخ

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

في الوقت الحقيقي رصد يجند مستقبلات التفاعل مع الإسفار نقل الطاقة الرنين

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

تعيين آثار ما بعد من ثيتا انفجار تحفيز على القشرة السمعية الإنسان مع التصوير الوظيفي

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

على صعيد رسم الخرائط الجينوم من المخدرات-DNA التفاعلات في الخلايا مع COSMIC (يشابك من الجزيئات الصغيرة لعزل لونين)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...