Name: iclip - transcriptome-wide mapping of protein-rna interactions with individual nucleotide resolution
Uploaded: 2011-04-30T14:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution at JoVE.com

Авторы выражают благодарность всем членам Уле, Ласкомб и Зупан лабораторий для обсуждения и экспериментальной помощи. Мы благодарим Джеймс Хэдфилд и Ник Мэтьюз для высокопроизводительного секвенирования. Мы хотели бы отметить, что метод iCLIP описанные здесь разделяет несколько шагов с оригинального протокола CLIP, разработанный Кирк Йенсен и JU в лаборатории Роберт Дарнелл. Работа выполнена при поддержке Европейского исследовательского совета грант 206726-CLIP для JU и долгосрочных гуманитарных наук границ программы стипендий для JK

<ol>
	<li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+regulons:+coordination+of+post-transcriptional+events.">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li><li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+regulation:+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code.">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> RNA. 14, 802-813 (2008).</li><li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+right+RNA:+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins.">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1071-1082 (1999).</li><li>Brooks, S. A., Rigby, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+mRNA+ligands+bound+by+the+RNA+binding+protein+hnRNP+A2+utilizing+a+novel+in+vivo+technique.">Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique.</a> Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).</li><li>Mili, S., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+reassociation+of+RNA-binding+proteins+after+cell+lysis:+implications+for+the+interpretation+of+immunoprecipitation+analyses.">Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses.</a> RNA. 10, 1692-1694 (2004).</li><li>Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302, 1212-1215 (2003).</li><li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+A+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells.">CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37, 376-386 (2005).</li><li>Licatalosi, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456, 464-469 (2008).</li><li>Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+code+for+the+FOX2+splicing+regulator+revealed+by+mapping+RNA-protein+interactions+in+stem+cells.">An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).</li><li>Urlaub, H., Hartmuth, K., L&#252;hrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-tracked+approach+to+analyze+RNA-protein+crosslinking+sites+in+native,+nonlabeled+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles.">A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Methods. 26, 170-181 (2002).</li><li>K&#246;nig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

С iCLIP протокол содержит широкий спектр ферментативных реакций и стадии очистки, это не всегда легко определить проблемы, когда эксперимент не удается. В целях контроля за специфичности выявленных РНК перекрестные ссылки сайтов, один или несколько отрицательных контролей следует поддерживать в течение полного опыта и последующего вычислительного анализа. Эти элементы управления могут быть не-антитело образца, не-сшитого клеток, или иммунопреципитации из нокаутом клеток или тканей. В идеале, эти контрольные опыты не должны очистить любой белок-РНК комплексов, и поэтому должны подавать сигнал на SDS-PAGE гель, и не обнаружить продукты после ПЦР. Высокая пропускная способность последовательности этих управляющих библиотеки должны вернуться немногих уникальных последовательностей. Нокдаун клетки не рекомендуется, поскольку последовательное управление, так как в результате последовательности все еще соответствуют перекрестные ссылки сайтов одного и того же белка, который очищается от нокдауна клеток в меньших количествах. Меры предосторожности должны быть приняты, чтобы избежать загрязнения продуктов ПЦР из предыдущих экспериментов. Лучший способ минимизации этой проблемы заключается в пространственно разделенных пред-и пост-ПЦР шагов. В идеале, анализ продуктов ПЦР и все последующие шаги должны выполняться в отдельной комнате. Более того, каждый член лаборатория должна использовать свой собственный набор буферов и других реагентов. Таким образом, источники загрязнения может быть легче идентифицировать.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2638">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution</a>. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to: "...as well as 2 &#x03BC;l Turbo DNase..." instead of: "...as well as 2 ml Turbo DNase..."

A correction to the article iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution was made.

Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Для гель-электрофореза и мембранных передачи мы рекомендуем те или использование XCell SureLock ® Mini-Cell и XCell II ™ Blot модуль Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), которая совместима с использованием различных minigels сборных, которые указаны в тексте всего протокола . Марка и номер заказа всех материалов, используемых упоминается в протоколе. Список ферментов, используемых в протоколе показан в таблице ниже. <table border="1"><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Catalogue # </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Белки Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> использование белка G на антитела мыши или козу </td></tr><tr><td> Я РНКазы </td><td> Амбион </td><td> AM2295 </td><td> деятельности может меняться от партии к партии </td></tr><tr><td> Т4 РНК-лигазы я </td><td> NEB </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> протеиназы К </td><td> Roche </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> Надстрочный III обратной транскриптазы </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> Эпицентр </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ СУПЕРМИКС я </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> этой смеси ПЦР дает наилучшие результаты в наших руках </td></tr></table>

iclip - transcriptome-wide mapping of protein-rna interactions with individual nucleotide resolution

Уникальный состав и пространственное расположение РНК-связывающими белками (ОДП) на стенограмму руководство различные аспекты пост-транскрипционной регуляции 1. Таким образом, важным шагом на пути к пониманию стенограмму регулирования на молекулярном уровне является получение информации о положении на местах связывания ОДП 2. Белково-РНК взаимодействия могут быть изучены с помощью биохимических методов, но эти подходы не решают связывание РНК в его родной сотовой связи. Первые попытки изучения белка-РНК комплексов в их клеточной среде занятых очисткой близость или иммунопреципитации комбинированные с дисплеем дифференциальных или микрочипов анализа (RIP-CHIP) 3-5. Эти подходы были склонны к определению косвенного или не-физиологических взаимодействий 6. В целях повышения специфичности и позиционные резолюцию, стратегия называется CLIP (УФ сшивания и иммунопреципитации) был введен 7,8. CLIP сочетает УФ сшивки белков и молекул РНК со строгой схемы очистки, включая денатурирующих электрофореза в полиакриламидном геле. В сочетании с высокой пропускной способностью технологии секвенирования, CLIP доказала, как мощный инструмент для изучения белок-РНК взаимодействий на геном масштабе (именуемые HITS-CLIP или CLIP-далее) 9,10. В последнее время PAR-CLIP была введена который использует фотореакционноспособных аналогов рибонуклеозид для сшивания 11,12. Несмотря на высокую специфичность полученных данных, CLIP эксперименты часто генерируют библиотек кДНК ограниченной сложности последовательности. Отчасти это связано с ограниченным количеством совместно очищенной РНК и два неэффективных лигирования РНК реакций, необходимых для подготовки библиотеки. Кроме того, анализы удлинения праймера показали, что многие кДНК усечение преждевременно в сшитый нуклеотидных 13. Такие усеченные кДНК теряются во время стандартного протокола библиотеки подготовки CLIP. Недавно мы разработали iCLIP (индивидуальные нуклеотидов разрешение CLIP), которая захватывает усеченной кДНК путем замены одного из неэффективных шагов межмолекулярного лигирования РНК с более эффективным внутримолекулярной кДНК рассылке (рис. 1) 14. Важно отметить, что секвенирование кДНК усеченной дает представление о положении перекрестные ссылки на сайт нуклеотидных разрешения. Мы успешно применяются для изучения iCLIP hnRNP С частица организации по геному масштабе и оценить ее роль в регуляции сплайсинга 14.

Watch this Scientific Journal Video about iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution at JoVE.com

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Пространственное расположение РНК-связывающими белками на стенограммы ключевым фактором, определяющим пост-транскрипционной регуляции. Поэтому мы разработали индивидуальный нуклеотидов разрешение сшивание УФ и иммунопреципитации (iCLIP), что позволяет точно генома отображение сайтов связывания РНК-связывающий белок.

iCLIP - транскриптома всей карты белка-РНК взаимодействия с отдельными нуклеотидных Резолюцию

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biology

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Неинвазивная 3D-визуализации с суб-микронных Резолюция Использование синхротронного рентгеновского томографии

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

Высвобождение дофамина в пресинаптические терминалы Индивидуальные Визуализированные с FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - метод идентификации транскриптома всей места связывания РНК-связывающие белки

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Хроматина анализ взаимодействия с парными-End тегов секвенирования (Chia-ПЭТ) для карт хроматина Взаимодействие и понимание регуляции транскрипции

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Мониторинг в реальном времени лиганд-рецепторных взаимодействий с флуоресцентной резонансного переноса энергии

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Сопоставление После эффектов Theta всплеск раздражения на человека слуховой коры с функциональной визуализации

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Быстрое и эффективное данио рерио Генотипирование Использование ПЦР с высоким разрешением расплава анализа

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Генома Отображение лекарственно-ДНК взаимодействий в клетках с космическими (сшивание малых молекул изолировать хроматина)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-след: Генома Отображение белок-ДНК взаимодействий с высокой пропускной секвенирования аденина-метилированных фрагментов ДНК

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...