Name: iclip - transcriptome-wide mapping of protein-rna interactions with individual nucleotide resolution
Uploaded: 2011-04-30T14:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution at JoVE.com

Författarna tackar alla medlemmar i Ule, Luscombe och Zupan laboratorier för diskussion och experimentell hjälp. Vi tackar James Hadfield och Nik Matthews för hög genomströmning sekvensering. Vi vill påpeka att iCLIP metod som beskrivs här aktierna flera steg med den ursprungliga CLIP-protokollet, som utvecklats av Kirk Jensen och HJ i laboratorium av Robert Darnell. Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet bevilja 206.726-klippet till HJ och en Långsiktig Human Frontiers Science Program gemenskap till JK

1. UV bryggbindningen av vävnadsodling celler <ol><li> Ta bort materialet och lägga till 6 ml iskall PBS till celler odlas i en 10 cm tallrik (räcker till tre experiment). </li><li> Ta bort locket och placera på is. Bestråla en gång med 150 mJ / cm 2 vid 254 nm. </li><li> Harvest cellerna genom att skrapa med en cell lyftare. </li><li> Överför 2 ml cellsuspension vardera till tre mikrorör. Snurra på högsta hastighet i 10 sek vid 4 ° C till pellets celler, ta sedan bort supernatanten. </li><li> Snap-frysa cellen pellets på torris och förvaras vid -80 ° C fram till användning. </li></ol> 2. Bead förberedelse <ol><li> Tillsätt 100 ìl av protein A Dynabeads (Dynal, 100,02) per försök till en ny mikrorör (Använd protein G Dynabeads för en mus eller antikroppar get). </li><li> Tvätta pärlor 2x med lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxikolat, 1 / 100 proteashämmare cocktail III Calbiochem). </li><li> Återsuspendera pärlor i 100 l lyseringsbuffert med 2-10 mikrogram antikropp. </li><li> Rotera rören i rumstemperatur i 30-60 min. </li><li> Tvätta 3x med 900 l lyseringsbuffert och lämna in den sista tvättningen tills de ska gå vidare till steg 4,1. </li></ol> 3. Cellslys och partiell RNA matsmältning <ol><li> Resuspendera cellpelleten i 1 ml lyseringsbuffert och överför till 1,5 ml mikrorör. </li><li> Bered en 1 / 500 utspädning av RNas I (Ambion, AM2295). Tillsätt 10 l RNas jag utspädning samt 2 l Turbo DNas till cellen lysat (1 / 500 RNas jag spädningar [låg RNas] används för biblioteket beredning, 1 / 50 utspädning [hög RNas] är nödvändiga för att kontrollera för antikroppar specificitet) . </li><li> Inkubera prov för exakt 3 min vid 37 ° C, skaka vid 1100 rpm. Överför omedelbart till is. </li><li> Spin vid 4 ° C och 22.000 gi 20 minuter för att rensa lysat. Försiktigt samla supernatanten (lämna ca 50 l lysat med pellets). </li></ol> 4. Immunoprecipitation <ol><li> Ta bort tvättbuffert från pärlor (från steg 2,5), lägg sedan till cellen lysat (från steg 3,4). </li><li> Rotera prover för 2 h vid 4 ° C. </li><li> Kasta bort vätskefasen och tvätta pärlor 2x med 900 l hög saltbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM EDTA; 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxikolat). </li><li> Tvätta 2x med 900 l tvättbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl 2, 0,2% Tween-20). </li></ol> 5. Defosforylationen av RNA 3&#39;ends <ol><li> Kassera supernatanten och suspendera pärlor i 20 l PNK blandning (15 l vatten, 4 l 5x PNK pH 6,5 buffert [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol], 0,5 l PNK enzym, 0,5 l RNasin [Promega]). </li><li> Inkubera 20 minuter vid 37 ° C. </li><li> Tillsätt 500 l tvättbuffert och tvätta 1x med hög salt-buffert. </li><li> Tvätta 2x med tvättbuffert. </li></ol> 6. Länkaren ligatur till RNA 3 &quot;slutar <ol><li> Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera pärlor i 20 l ligation mix (9 l vatten, 4 l 4x ligation buffert [200 mMTris-HCl, 40m MM GCL 2, 40 mM ditiotreitol], 1 l-RNA ligas [NEB], 0,5 l RNasin [Promega], 1,5 l före adenylated länkare L3 [20 mikroM], 4 l PEG400 [81.170, Sigma]). </li><li> Inkubera över natten vid 16 ° C. </li><li> Tillsätt 500 l tvättbuffert och tvätta sedan 2x med 1 ml hög salt-buffert. </li><li> Tvätta 2x med 1 ml tvättbuffert och lämna i 1 ml av den andra tvätten. </li></ol> 7. RNA 5 &#39;slut märkning <ol><li> Avlägsna supernatanten och suspendera pärlor i 8 l varmt PNK mix (0,4 l PNK [NEB], 0,8 l 32 P-γ-ATP, 0,8 l 10x PNK buffert [NEB], 6 l vatten). </li><li> Inkubera 5 minuter vid 37 ° C. </li><li> Ta ut den varma PNK mixen och resuspendera pärlor i 20 l 1x Nupage buffert (Invitrogen). </li><li> Inkubera på en thermomixer vid 70 ° C i 10 min. </li><li> Placera omedelbart på en magnet för att fälla den tomma pärlor och ladda supernatanten på gelen (se steg 8). </li></ol> 8. SDS-PAGE och membran överföra <ol><li> Ladda prover på en 4-12% NuPAGE Bis-Tris gel (Invitrogen) enligt tillverkarens anvisningar. Använd 0,5 l 1x MOPS löpande buffert (Invitrogen). Även belastning 5 ìl av en pre-färgad protein storlek markör (till exempel PAGE härskare plus, Fermentas, SM1811). </li><li> Kör gelen i 50 min vid 180 V. </li><li> Ta bort gelen fram och kasta som fast avfall (innehåller fri radioaktiva ATP). </li><li> Överför protein-RNA komplex från gelen till ett nitrocellulosa membran med Novex våta överföringen apparater enligt tillverkarens anvisningar (Invitrogen, överför 1 h vid 30 V). </li><li> Efter överföringen, skölj membranet i PBS-buffert, sedan linda in det i Saran wrap och utsätt det för en Fuji film på -80 ° C (placera en fluorescerande klistermärke intill membranet att senare anpassa than film och membranet, utföra exponering i 30 min, 1 timme och över natten). </li></ol> 9. RNA-isolering <ol><li> Isolera protein-RNA komplex från låg-RNas experimentera med autoradiograph från steg 8,5 som en mask. Klipp denna bit av membranet i flera små skivor och placera dem i en 1,5 ml mikrorör. </li><li> Tillsätt 200 l PK buffert (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) och 10 l proteinas K (Roche 03115828001) till membranet bitar. Inkubera skaka vid 1100 rpm i 20 minuter vid 37 ° C. </li><li> Tillsätt 200 ìl PKurea buffert (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 7 M urea) och inkubera i 20 minuter vid 37 ° C. </li><li> Samla lösning och tillsätt det tillsammans med 400 l av RNA-fenol / kloroform (Ambion, 9722) till en 2 ml Phase Lock Gel Tunga rör (713-2536, VWR). </li><li> Inkubera 5 minuter vid 30 ° C, skaka vid 1100 rpm. Separera faserna genom att snurra i 5 min vid 13.000 rpm vid rumstemperatur. </li><li> Överför vattenskiktet i en ny tub (var försiktig att inte röra gelen med pipett). Tillsätt 0,5 l glycoblue (Ambion, 9510) och 40 l 3 M natriumacetat pH 5,5 och blanda. Tillsätt sedan 1 ml 100% etanol, blanda igen och fällningen över natten vid -20 ° C. </li></ol> 10. Omvänd transkription <ol><li> Spin i 20 min vid 15.000 rpm och 4 ° C. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten med 0,5 ml 80% etanol. </li><li> Återsuspendera pelleten i 7,25 l RNA / primermix (6,25 l vatten, 0,5 l Rclip primer [0.5pmol/μl], 0,5 l dNTP mix [10 mM]). För varje experiment eller kopiera, använda en annan Rclip primer innehåller enskilda streckkod sekvenser (se 14). </li><li> Inkubera 5 minuter vid 70 ° C innan kylning till 25 ° C. </li><li> Tillsätt 2,75 l RT blandning (2 l 5x RT-buffert, 0,5 l 0,1 miljoner DTT, 0,25 l Upphöjd III omvänt transkriptas [Invitrogen]). </li><li> Inkubera 5 minuter vid 25 ° C, 20 minuter vid 42 ° C, 40 min vid 50 ° C och 5 min vid 80 ° C innan kylning till 4 ° C. </li><li> Tillsätt 90 l TE buffert, 0,5 l glycoblue och 10 l natriumacetat pH 5,5 och blanda. Tillsätt sedan 250 l 100% etanol, blanda igen och fällningen över natten vid -20 ° C. </li></ol> 11. Gel rening av cDNA <ol><li> Spin ner och tvätta proverna (se 10.1), sedan resuspendera pellets i 6 l vatten. </li><li> Tillsätt 6 l 2x TBE-urea buffert (Invitrogen). Värm prover till 80 ° C i 3 min direkt före lastning. </li><li> Ladda prover på en prefabricerad 6% TBE-urea gel (Invitrogen) och kör i 40 min vid 180 V som enligt tillverkaren. Också ladda en låg molekylvikt markör för efterföljande skärning (se nedan). </li><li> Skär tre band på 120-200 NT (hög), 85-120 NT (medium) och 70-85 NT (låg). Använd theupper färgämnet och märken på plasten gelen stöd för att vägleda excision (se figur 3). Observera att Rclip primer och L3 sekvensen tillsammans står för 52 nt av klippet sekvensen. </li><li> Tillsätt 400 l TE och krossa gelen skär i små bitar med hjälp av en 1 ml spruta kolven. Inkubera skaka vid 1100 rpm under 2 h vid 37 ° C. </li><li> Placera två 1 cm glas förfilter (Whatman, 1.823.010) till en Costar Spinx kolumn (Corning Incorporated, 8161). Överför vätskan del av provet till kolonnen. Spin i 1 min vid 13 tusen varv i ett 1,5 ml rör. </li><li> Tillsätt 0,5 l glycoblue och 40 l natriumacetat pH 5,5, blanda provet. Tillsätt 1 ml 100% etanol, blanda igen och fällningen över natten vid -20 ° C. </li></ol> 12. Ligatur grundfärg till 5&#39;end av cDNA <ol><li> Spin ner och tvätta proverna (se 10.1), sedan resuspendera pellets i 8 l ligation mix (6,5 l vatten, 0,8 l 10x CircLigase Buffer II, 0,4 l 50 mM MnCl 2, 0,3 l, Circligase II [Epicentrum]) och inkubera för 1 h vid 60 ° C. </li><li> Tillsätt 30 l oligo glödgning blandning (26 l vatten, 3 l FastDigest buffert [Fermentas], 1 l cut_oligo [10 mikroM]). Inkubera i 1 min vid 95 ° C. Sedan minska temperaturen var 20 sek med 1 ° C tills 25 ° C uppnås. </li><li> Tillsätt 2 l BamHI (Fast Fermentas) och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C. </li><li> Tillsätt 50 l TE och 0,5 l glycoblue och blanda. Tillsätt 10 l pH natriumacetat 5,5 och blanda, lägg sedan till 250 l 100% etanol. Blanda igen och fällningen över natten vid -20 ° C. </li></ol> 13. PCR-amplifiering <ol><li> Spin ner och tvätta proverna (se 10.1), sedan suspendera pelleten i 19 l vatten. </li><li> Bered PCR-mix (19 l cDNA, 1 l primermix P5/P3 Solexa, 10 mikroM vardera, 20 l Accuprime Supermix ett enzym [Invitrogen]). </li><li> Kör följande PCR-program: 94 ° C under 2 min, [94 ° C i 15 sekunder, 65 ° C under 30 sek, 68 ° C i 30 sek] 25-35 cykler, 68 ° C i 3 min, 4 ° C för alltid. </li><li> Blanda 8 l PCR-produkten med 2 ìl 5x TBE-buffert och last på en prefabricerad 6% TBE gel (InvitRogen). Fläck gelen med Sybrgreen I (Invitrogen) och analysera med en gel värmekamera. </li><li> Streckkoden i Rclip primers låt multiplex olika prover innan du skickar in för hög genomströmning sekvensering. Skicka in 15 ìl av biblioteket för sekvensering och spara resten. </li></ol> 14. Länkare och primer sekvenser Pre-adenylated 3 &quot;länkare DNA: [Vi beställer DNA adaptern från IDT och sedan göra portioner av 20 mikroM.] <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="DNA" /> 15. Representativa resultat: Innan sekvensering av iCLIP biblioteket kan framgång försöket övervakas på två steg: autoradiograph av protein-RNA komplex efter membran överföring (steg 8,5) och den bild av gelen av PCR-produkter (steg 13,4). I autoradiograph av låg-RNase stickprov bör diffusa radioaktivitet ses över molekylvikt av proteinet (Figur 2, exempel 4). För hög RNase prover, detta är radioaktivitet fokuserat närmare molekylvikt av proteinet (Figur 2, exempel 3). När ingen antikroppar används i immunoprecipitation bör ingen signal detekteras (Figur 2, exempel 1 och 2). Ytterligare viktiga kontroller för specificitet immunoprecipitation antingen utelämna UV-strålning eller celler använder som inte uttrycker proteinet av intresse 14. Gelen bilden av PCR-produkterna (steg 13,4) ska visa en storleksordning som motsvarar cDNA fraktion (hög, medel eller låg) renas i steg 11,4 (Figur 4, banor 4-6). Observera att PCR-primers P3Solexa och P5Solexa införa ytterligare 76 NT till storleken på cDNA. Om inga antikroppar används under immunoprecipitation bör inga motsvarande PCR-produkterna kan detekteras (Figur 4, banor 1-3). Primer dimer produkt kan visas på ca 140 NT. För representativa resultat av hög genomströmning sekvensering och efterföljande bioinformatiska analyser se 14. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Schematisk representation av iCLIP protokollet. Protein-RNA komplex är kovalent tvärbunden in vivo med hjälp av UV-strålning (steg 1). Proteinet av intresse renas tillsammans med bundna RNA (steg 2-5). För att möjliggöra sekvensspecifika priming av omvänd transkription, är ett RNA-adapter knyts ihop till 3 &#39;änden av RNA, medan 5 &quot;slutet är radioaktivt märkt (steg 6 och 7). Tvärbunden protein-RNA komplex är renade från gratis RNA med hjälp av SDS-PAGE och membran överföring (steg 8). RNA återvinns från membranet genom uppslutning av proteinet med proteinas K lämnar en polypeptid kvar på korset-link nukleotid (steg 9). Omvänd transkription (RT) trunkerar på återstående polypeptid och introducerar två cleavable adaptern regioner och sekvenser streckkod (steg 10). Val av storlek tar bort fri RT primer innan circularization. Följande linjärisering genererar lämpliga mallar för PCR-amplifiering (steg 11-15). Slutligen genererar hög genomströmning sekvensering läser där streckkoden sekvenser omedelbart följs av den sista nukleotid av cDNA (steg 16). Eftersom detta nukleotid lokaliserar ett läge uppströms tvärbunden nukleotid kan bindningsstället härledas med hög upplösning. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Autoradiograph av tvärbunden hnRNP C-RNA komplex med denaturering gelelektrofores och membran överföring. hnRNP C-RNA komplex var immun-renat från cell extrakt med hjälp av en antikropp mot hnRNP C (α hnRNP C, prov 3 och 4). RNA var delvis smälta med låg (+) eller hög (+ +) koncentration av RNas. Komplex förskjutning uppåt från storleken på protein (40 kDa) kan observeras (prov 4). Övergången är mindre uttalad vid höga koncentrationer av RNas användes (prov 3). Det radioaktiva signalen försvinner när ingen antikroppar användes i immunoprecipitation (prov 1 och 2). <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Schematisk 6% TBE-urea gel (Invitrogen) för att styra excision av iCLIP cDNA produkter. Gelen körs för 40 min vid 180 V vilket leder till en reproducerbar migration mönster av cDNAs och färgämnen (ljust och mörkt blått) i gelen. Använd ett rakblad för att skära (röda linjen) till hög (H), medel (M) och låg (L) cDNA bråk. Börja med att skära i mitten av ljusblå färg och ovanför märket på plast gelen kassetten. Dela medium och låg fraktioner och trimma hög andel ca 1 cm ovanför ljusblå färg. Använd vertikalt snitt styrs av fickorna och färgen att skilja de olika köer (i detta exempel 1-4). Markören Lane (m) kan färgas och avbildas för att styrastorlekar efter kapning. Fragment storlekar anges till höger. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. Analys av PCR-förstärkta iCLIP cDNA bibliotek med hjälp av gelelektrofores. RNA återhämtat sig från membranet (Figur 1) var omvänd transkriberat och storlek-renas med hjälp av denatureringen gelelektrofores (Figur 2). Tre stora delar av cDNA (hög [H]: 120-200 nt, medium [M]: 85-120 nt och låga [L]: 70-85 NT) omhändertogs, circularized, re-linjär och PCR-förstärkning. PCR-produkter av olika storleksfördelning kan observeras som ett resultat av de olika storlekarna av den ingående fraktioner. Eftersom PCR primern introducerar 76 nt till cDNA, bör storlek varierar mellan 196-276 nt för hög, 161-196 nt för medelstora och 146-161 NT för liten storlek fraktioner. PCR-produkterna är frånvarande när ingen antikroppar har använts för immunoprecipitation (körfält 1-3).

<ol>
	<li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+regulons:+coordination+of+post-transcriptional+events.">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li><li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+regulation:+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code.">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> RNA. 14, 802-813 (2008).</li><li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+right+RNA:+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins.">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1071-1082 (1999).</li><li>Brooks, S. A., Rigby, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+mRNA+ligands+bound+by+the+RNA+binding+protein+hnRNP+A2+utilizing+a+novel+in+vivo+technique.">Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique.</a> Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).</li><li>Mili, S., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+reassociation+of+RNA-binding+proteins+after+cell+lysis:+implications+for+the+interpretation+of+immunoprecipitation+analyses.">Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses.</a> RNA. 10, 1692-1694 (2004).</li><li>Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302, 1212-1215 (2003).</li><li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+A+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells.">CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37, 376-386 (2005).</li><li>Licatalosi, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456, 464-469 (2008).</li><li>Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+code+for+the+FOX2+splicing+regulator+revealed+by+mapping+RNA-protein+interactions+in+stem+cells.">An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).</li><li>Urlaub, H., Hartmuth, K., L&#252;hrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-tracked+approach+to+analyze+RNA-protein+crosslinking+sites+in+native,+nonlabeled+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles.">A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Methods. 26, 170-181 (2002).</li><li>K&#246;nig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).</li></ol>

Eftersom iCLIP protokollet innehåller ett varierat utbud av enzymatiska reaktioner och steg rening, är det inte alltid lätt att identifiera ett problem när ett experiment misslyckas. För att kontrollera för specificitet identifierade RNA cross-link webbplatser bör en eller flera negativa kontroller hållas under hela försöket och efterföljande beräkningar analyser. Dessa kontroller kan vara no-antikroppen prov, den icke-tvärbundet celler, eller immunoprecipitation från knockout-celler eller vävnader. Helst bör dessa kontrollmekanismer experiment rena inga protein-RNA komplex, och därför bör ge någon signal på SDS-PAGE gel, och ingen mätbar produkter efter PCR-amplifiering. Hög genomströmning sekvensering av dessa kontroll biblioteken bör återgå mycket få unika sekvenser. ÖVERVÄLDIGANDE celler rekommenderas inte som en sekvensering kontroll, eftersom den resulterande sekvenser fortfarande motsvarar över Länk sajter av samma protein, som är renat från ÖVERVÄLDIGANDE celler i mindre kvantiteter. Försiktighetsåtgärder bör också vidtas för att undvika kontaminering med PCR-produkter från tidigare experiment. Det bästa sättet att minimera detta problem är att rumsligt åtskilda pre-och post-PCR steg. Helst bör en analys av PCR-produkter och alla efterföljande steg ska utföras i ett separat rum. Vidare bör varje medlem i laboratoriet använder sin egen uppsättning av buffertar och andra reagenser. På detta sätt kan föroreningskällor vara lättare identifieras.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2638">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution</a>. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to: "...as well as 2 &#x03BC;l Turbo DNase..." instead of: "...as well as 2 ml Turbo DNase..."

A correction to the article iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution was made.

Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

För gelelektrofores och membran överför vi rekommenderar t han använder XCell SureLock ® Mini-Cell och XCell II ™ Blot Module Kit CE-märkning (Invitrogen, EI0002), som är kompatibel med användningen av de olika prefabricerade minigels som är angivna i hela protokollet . Varumärket och ordernummer av allt använt material nämns under protokollet. Listan av enzymer som används i protokollet framgår av tabellen nedan. <table border="1"><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Catalogue # </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Protein A Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> använder protein G för mus eller get antikropp </td></tr><tr><td> RNas jag </td><td> Ambion </td><td> AM2295 </td><td> aktivitet kan byta från parti till parti </td></tr><tr><td> T4 RNA ligas jag </td><td> NEB </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> proteinas K </td><td> Roche </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> Upphöjd III omvänt transkriptas </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> Epicentrum </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ SuperMix jag </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> denna PCR-mix ger bäst resultat i våra händer </td></tr></table>

iclip - transcriptome-wide mapping of protein-rna interactions with individual nucleotide resolution

Den unika sammansättning och rumsliga arrangemang av RNA-bindande proteiner (RBPs) på en avskrift styra olika aspekter av post-transkriptionell reglering 1. Därför är ett viktigt steg mot att förstå avskrift reglering på molekylär nivå för att få positionsinformation om bindningar på RBPs 2. Protein-RNA interaktioner kan studeras med biokemiska metoder, men dessa metoder inte adressen RNA bindande i dess ursprungliga cellulära sammanhang. Inledande försök att studera protein-RNA komplex i sin cellulära miljö anställd affinitet rening eller immunoprecipitation kombinerat med differential display eller microarray analys (RIP-CHIP) 3-5. Dessa metoder var benägna att identifiera indirekta eller icke-fysiologiska samspel 6. För att öka specificiteten och positionella upplösning, som en strategi för att så CLIP (UV tvärbindning och immunoprecipitation) infördes 7,8. CLIP kombinerar UV tvärbindning av proteiner och RNA-molekyler med rigorösa rening system inklusive denaturering polyakrylamidgelelektrofores. I kombination med hög genomströmning sekvensering teknik, har CLIP visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att studera protein-RNA interaktioner på en genomet-omfattande (kallas HITS-klipp eller CLIP-punkter) 9,10. Nyligen var PAR-CLIP infördes som använder fotoreaktiva ribonucleoside analoger för förnätning 11,12. Trots den höga specificitet av erhållna data, CLIP experiment leder ofta till cDNA bibliotek av begränsad sekvens komplexitet. Detta beror delvis på den begränsade mängden co-renade RNA och två ineffektiva RNA reaktioner ligation krävs för biblioteket beredning. Dessutom visade primer förlängning analyser som många cDNAs trunkera förtid på tvärbunden nukleotid 13. Sådana trunkerad cDNAs försvinner under standarden CLIP biblioteket förberedelse protokollet. Vi utvecklade nyligen iCLIP (individ-nucleotide upplösning CLIP), som fångar den trunkerade cDNAs genom att ersätta en av de ineffektiva intermolekylära RNA ligation steg med en mer effektiv intramolekylära cDNA circularization (Figur 1) 14. Viktigt sekvensering den trunkerade cDNAs ger insikter i position över länken plats hos nukleotid upplösning. Vi tillämpats med framgång iCLIP att studera hnRNP C partikel organisation på ett genomet-omfattande och bedöma dess roll i skarvning Regel 14.

Watch this Scientific Journal Video about iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution at JoVE.com

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Den rumsliga arrangemang av RNA-bindande proteiner på en utskrift är en viktig faktor för post-transkriptionell reglering. Därför utvecklade vi individuella nukleotida crosslinking upplösning UV och immunoprecipitation (iCLIP) som ger en exakt genomet hela kartläggning av bindningar på ett RNA-bindande protein.

iCLIP - transkriptom hela Kartläggning av protein-RNA interaktioner med individuella Nukleotid Upplösning

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biology

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Icke-invasiv 3D-visualisering med submikrona upplösning Använda Synchrotron-röntgen-tomografi

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

Dopamin Släpp på enskilda Presynaptiska Terminaler visualiseras med FFNS

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - En metod för att identifiera transkriptom hela bindningar på RNA-proteiner

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Kromatin Interaktion Analys med parade-End Tag sekvensering (CHIA-PET) för kartläggning kromatin Interaktioner och förstå transkriptionsreglering

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Realtidsövervakning av ligand-receptor interaktion med fluorescensresonansenergiöverföring

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Kartläggning av efterverkningarna av Theta skurstimuleringen om den mänskliga hörselbarken med funktionella Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Snabb och effektiv Zebrafish Genotyping Använda PCR med hög upplösning Smält Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genomvid Kartläggning av narkotika DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tvärbindning av små molekyler att isolera Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-punkter: Genomvid Kartläggning av protein-DNA interaktioner från hög genomströmning sekvensering av Adenine-metylerade DNA-fragment

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...