Name: bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2011-04-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bimolecular Fluorescence Complementation at JoVE.com

وITSN ، PI3K C2β ، وناقلات التحكم المستخدمة في هذا البروتوكول متاحة من الكتاب بناء على طلبها ، لأغراض غير تجارية فقط. الكتاب نود أن ننوه الدكتور تشانغ دينغ هو جين تاو لتقديم المشورة وتتكرم الكواشف المستخدمة في إنشاء بروتوكول BiFC في المختبر O&#39;Bryan. وأيد كاو من خلال تمويل من مؤسسة جيروم لوجون. ويدعم العمل في المختبر O&#39;Bryan من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة وزارة الدفاع (HL090651) (PR080428) ، مؤسسة Baldrick سانت ، وجيروم لوجون المؤسسة.

ألف BiFC المعايرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار fluorophore هناك fluorophores متعددة ، مثل YFP والزهرة ، التي تعمل بشكل جيد كشركاء الانصهار BiFC (الجدول 1). تاريخ الأمينية وكربوكسي محطة - فينوس قادرون على تشكيل المجمع في 37 درجة مئوية ، في حين أن شظايا...

<ol>
	<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation.">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+by+protein+fragment+complementation+strategies.">Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies.</a> Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).</li><li>Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+strategies+to+delineate+MAP+kinase+signaling+pathways+using+protein-fragment+complementation+assays+(PCA).">Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA).</a> Methods. 40, 287-293 (2006).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li><li>Martin, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+regulates+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis,+ubiquitylation,+and+signaling.">Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling.</a> Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).</li><li>Das, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron+survival+through+an+intersectin-phosphoinositide+3'-kinase+C2beta-AKT+pathway.">Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway.</a> Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).</li><li>Mohney, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving.">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li><li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+can+regulate+the+Ras/MAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis.">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li><li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis,+activates+mitogenic+signaling+pathways.">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li><li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogenesis+and+endocytosis:+What's+at+the+INTERSECTIoN?.">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?.</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET.">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li></ol>

BiFC هو وسيلة ممتازة لتصور البروتين : تفاعلات البروتين في الخلايا كلها وتحديد توطين التحت خلوية من هذه المجمعات. مزايا BiFC فقط هي التي تتفاعل البروتينات هي الفلورسنت ، واستقرت تفاعلات عابرة ، وبعد معالجة البيانات التصوير هو الحد الأدنى. اثنين من مساوئ هذه الطريقة هي الو...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>35-011-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matek</td>
<td>P35G-1.5-14C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>35-3846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18324020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM510 META</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation

تحديد التوزيع التحت خلوية المجمعات إشارة لا بد من فهم أن الإخراج من التعقيد. الأساليب التقليدية مثل مناعي لا تقدم معلومات على توطين المكاني للمجمعات. في المقابل ، BiFC يراقب التفاعل والتقسيم التحت خلوية مجمعات البروتين. في هذه الطريقة ، يتم تقسيم البروتين fluororescent إلى أجزاء غير الفلورسنت الأمينية وكربوكسي المحطة ، التي تنصهر بعد ذلك إلى اثنين من البروتينات المثيرة للاهتمام. تفاعل البروتينات النتائج في إعادة تشكيل fluorophore (الشكل 1) 1،2. وجود قيود على BiFC أنه بمجرد تشكيل لfluorophore تجزئة معقدة لا رجعة فيه 3. هذا القيد هو مفيد في الكشف عن التفاعلات عابرة أو ضعيفة ، ولكن ما يحول دون إجراء تحليل للديناميات الحركية المعقدة. تحذيرا إضافيا هو أن flourophore يتطلب إعادة 30min حتى تنضج ويتألق ، النافية مرة أخرى مراقبة التفاعلات الوقت الحقيقي 4. BiFC هو مثال محدد للتكامل فحص البروتين شظية (PCA) الذي يعمل مراسلا من البروتينات مثل بروتين الفلورية الخضراء المتغيرات (BiFC) ، dihydrofolate مختزلة ، ب اكتاماز ، وluciferase لقياس البروتين : البروتين 5،6 التفاعلات. طرق بديلة لدراسة البروتين : تفاعلات البروتين في الخلايا وتشمل الطاقة مضان بالرنين شارك في توطين ونقل فورستر (الحنق) 7. لتوطين المشترك ، والموسومة فردي اثنين من البروتينات إما مباشرة مع fluorophore المناعي أو غير مباشر. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يؤدي إلى خلفية عالية من البروتينات غير التفاعل مما يجعل من الصعب تفسير شارك في توطين البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للحدود قرار المجهري متحد البؤر ، قد تظهر اثنين من البروتينات المشترك المترجمة دون التفاعل بالضرورة. مع BiFC ، يلاحظ فقط مضان عندما اثنين من البروتينات الفائدة تفاعل. الحنق آخر هو طريقة ممتازة لدراسة البروتين : البروتين التفاعلات ، ولكن يمكن أن يكون تحديا تقنيا. الحنق التجارب تتطلب المانحة ومتقبل لتكون مماثلة من السطوع ورياضيات الكيمياء في الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، لا بد من حساب واحد عن طريق التسييل من المانحين في القناة متقبل والعكس بالعكس. بخلاف الحنق ، BiFC ومضان الخلفية قليلا ، وبعد تجهيز البيانات القليل من الصور ، لا يتطلب overexpression عالية ، ويمكن الكشف عن التفاعلات الضعيفة أو عابرة. نقل الطاقة الرنين ضوء بارد (بريت) هي طريقة مشابهة لالحنق باستثناء الجهة المانحة هو انزيم (مثل luciferase) الذي يحفز لتصبح ركيزة bioluminescent مثيرة مما يتسبب المتقبلة. بريت يفتقر المشاكل التقنية عن طريق التسييل ومضان خلفية عالية لكنه يفتقر الى القدرة على توفير المعلومات المكانية نظرا لعدم وجود ركيزة لتوطين المقصورات الخاصة 8. عموما ، BiFC هو وسيلة ممتازة لتصور التعريب التحت خلوية مجمعات البروتين لاكتساب نظرة ثاقبة يشير مجزأة.

Watch this Scientific Journal Video about Bimolecular Fluorescence Complementation at JoVE.com

Bimolecular Fluorescence Complementation

توطين التحت خلوية من البروتينات مهم في تحديد لائحة المكانية والزمانية لمن إشارات الخلية. هنا ، نحن تصف تكامل مضان ثنائي الجزيء (BiFC) كوسيلة مباشرة لرصد التفاعلات المكانية من البروتينات في الخلية.

الإسفار التكملة ثنائي الجزيء

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

الكشف عن تفاعلات البروتين في النبات باستخدام عبارة الإسفار ثنائي الجزيء المتوافقة التكملة (BiFC) نظام

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Cryosectioning المجتمعات الخميرة لفحص أنماط الإسفار

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

التصوير مضان مع نانومتر دقة واحدة (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...