Name: bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2011-04-15T14:00:00
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Le ITSN, PI3K-C2β, et les vecteurs de contrôle utilisés dans ce protocole sont disponibles auprès des auteurs sur demande, pour des fins non commerciales seulement. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Chang-Hu Deng a bien voulu fournir des conseils et des réactifs utilisés dans l&#39;établissement du protocole de BiFC dans le laboratoire O&#39;Bryan. KAW a été soutenu par un financement de la Fondation Lejeune-Jérôme. Le travail dans le laboratoire O&#39;Bryan est soutenu par des subventions du NIH (HL090651), le DOD (PR080428), la Fondation Saint-Baldrick, et la Fondation Jérôme Lejeune.

A. BiFC étalonnage <ol><li> Choisissez un fluorophore. Il ya des fluorophores multiples, tels que la YFP et Vénus, qui fonctionnent bien comme des partenaires de fusion BiFC (tableau 1). Extrémités amino-et carboxy-terminale de Vénus sont en mesure de former un complexe à 37 ° C, tandis que les fragments YFP BiFC nécessitent une pré-incubation à 30 ° C afin de faciliter la formation de deux fluorophores. Cette incubation à basse température peut modifier certains processus cell...

<ol>
	<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation.">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+by+protein+fragment+complementation+strategies.">Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies.</a> Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).</li><li>Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+strategies+to+delineate+MAP+kinase+signaling+pathways+using+protein-fragment+complementation+assays+(PCA).">Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA).</a> Methods. 40, 287-293 (2006).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li><li>Martin, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+regulates+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis,+ubiquitylation,+and+signaling.">Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling.</a> Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).</li><li>Das, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron+survival+through+an+intersectin-phosphoinositide+3'-kinase+C2beta-AKT+pathway.">Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway.</a> Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).</li><li>Mohney, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving.">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li><li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+can+regulate+the+Ras/MAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis.">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li><li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis,+activates+mitogenic+signaling+pathways.">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li><li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogenesis+and+endocytosis:+What's+at+the+INTERSECTIoN?.">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?.</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET.">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li></ol>

BiFC est une excellente méthode pour visualiser des protéines: les interactions entre protéines dans des cellules entières et de déterminer la localisation subcellulaire de ces complexes. Les avantages de BiFC sont que seulement les protéines en interaction sont fluorescentes, les interactions transitoires sont stabilisées, et le post-traitement des données d&#39;imagerie est minime. Deux inconvénients de cette méthode sont le temps de maturation pour le fluorophore et l&#39;irréversibilité des complexes flu...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>35-011-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matek</td>
<td>P35G-1.5-14C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>35-3846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18324020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM510 META</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation

Définition de la distribution subcellulaire des complexes de signalisation est impératif de comprendre la sortie de ce complexe. Les méthodes conventionnelles telles que immunoprécipitation ne fournissent pas d&#39;informations sur la localisation spatiale des complexes. En revanche, BiFC surveille l&#39;interaction et la compartimentation subcellulaire des complexes protéiques. Dans cette méthode, une protéine fluororescent est divisé en amino-et carboxy-terminale non fluorescent fragments qui sont ensuite fusionnées à deux protéines d&#39;intérêt. Interaction des résultats des protéines dans la reconstitution du fluorophore (figure 1) 1,2. Une limitation de BiFC n&#39;est qu&#39;une fois que le fluorophore fragmenté est reconstitué le complexe est irréversible 3. Cette limitation est avantageuse dans la détection des interactions transitoires ou faible, mais s&#39;oppose à une analyse cinétique de la dynamique complexe. Une mise en garde supplémentaire est que le flourophore reconstituée nécessite 30min à mûrir et à fluorescence, à nouveau obstacle à l&#39;observation des interactions en temps réel 4. BiFC est un exemple précis du dosage de complémentation protéique fragment (PCA) qui emploie des protéines telles que le vert journaliste de variants de la protéine fluorescente (BiFC), la dihydrofolate réductase, b-lactamase, et la luciférase pour mesurer des protéines: les interactions entre protéines 5,6. Les méthodes alternatives à l&#39;étude des protéines: les interactions entre protéines dans les cellules comprennent la fluorescence de co-localisation et de Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 7. Pour la co-localisation, deux protéines sont individuellement marqués soit directement avec un fluorophore ou par immunofluorescence indirecte. Cependant, cette approche conduit à fond élevé de non-interaction des protéines ce qui rend difficile d&#39;interpréter la co-localisation des données. En outre, en raison de la limite de résolution de la microscopie confocale, deux protéines peuvent apparaître co-localisées, sans nécessairement interagir. Avec BiFC, la fluorescence n&#39;est observée lorsque les deux protéines d&#39;intérêt interagissent. FRET est une autre excellente méthode pour étudier les protéines: les interactions entre protéines, mais peut être techniquement difficile. FRET expériences exigent des donneurs et accepteurs d&#39;être d&#39;une luminosité similaire et la stœchiométrie dans la cellule. En outre, on doit tenir compte de saigner à travers les bailleurs de fonds dans le canal de l&#39;accepteur et vice versa. Contrairement FRET, BiFC a peu de fond de fluorescence, de post-traitement peu de données d&#39;image, ne nécessite pas de surexpression élevé, et peut détecter des interactions faibles ou transitoires. Transfert d&#39;énergie par résonance de bioluminescence (BRET) est une méthode similaire à l&#39;exception de FRET le donateur est une enzyme (luciférase, par exemple) qui catalyse un substrat de devenir bioluminescents donc passionnante un accepteur. BRET manque les problèmes techniques de saigner à travers et la fluorescence de fond élevé, mais n&#39;a pas la capacité de fournir des informations spatiales en raison du manque de substrat à la localisation des compartiments spécifiques 8. Globalement, BiFC est une excellente méthode pour visualiser la localisation subcellulaire des complexes de protéines afin de mieux comprendre la signalisation compartimentée.

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Bimolecular Fluorescence Complementation

La localisation subcellulaire des protéines est important dans la détermination de la régulation spatio-temporelle de la signalisation cellulaire. Ici, nous décrivons bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) comme une méthode simple pour le suivi des interactions spatiale des protéines dans la cellule.

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