Name: bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2011-04-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bimolecular Fluorescence Complementation at JoVE.com

ITSN, PI3K-C2β ו וקטורים לשלוט בשימוש בפרוטוקול זה זמינים המחברים על פי דרישה, עבור לא מסחריות בלבד. המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר צ&#39;אנג הו דנג עבור חביב במתן ייעוץ ו ריאגנטים השתמשו בהקמת פרוטוקול BiFC במעבדה O&#39;Bryan. Kaw נתמך על ידי מימון של ג&#39;רום קרן לז&#39;ן. עבודה במעבדה O&#39;Bryan נתמך על ידי תרומות של (HL090651) NIH, DOD (PR080428), קרן Baldrick סנט, ואת ג&#39;רום קרן לז&#39;ן.

א BiFC כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר fluorophore. ישנם fluorophores מרובים, כגון YFP ונוגה, שפועלים גם שותפים BiFC היתוך (טבלה 1). מסתיים אמינו ו-carboxy הטרמינל של ונוס מסוגלים ליצור מורכבות על 37 מעלות צלזיוס, בעוד שברי BiFC YFP דורשים הדגירה טרום ב 30 ° C כד?...

<ol>
	<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation.">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+by+protein+fragment+complementation+strategies.">Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies.</a> Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).</li><li>Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+strategies+to+delineate+MAP+kinase+signaling+pathways+using+protein-fragment+complementation+assays+(PCA).">Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA).</a> Methods. 40, 287-293 (2006).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li><li>Martin, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+regulates+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis,+ubiquitylation,+and+signaling.">Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling.</a> Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).</li><li>Das, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron+survival+through+an+intersectin-phosphoinositide+3'-kinase+C2beta-AKT+pathway.">Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway.</a> Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).</li><li>Mohney, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving.">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li><li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+can+regulate+the+Ras/MAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis.">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li><li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis,+activates+mitogenic+signaling+pathways.">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li><li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogenesis+and+endocytosis:+What's+at+the+INTERSECTIoN?.">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?.</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET.">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li></ol>

BiFC היא שיטה מצוינת חזותי חלבון: אינטראקציות חלבון בתאים שלמים בקביעת לוקליזציה subcellular של קומפלקסים אלה. היתרונות של BiFC הן כי רק חלבונים אינטראקציה הם פלורסנט, אינטראקציות חולף הם התייצבו, שלאחר עיבוד של הנתונים הדמיה היא מינימלית. שני החסרונות של שיטה זו הינם זמן ההב?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>35-011-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matek</td>
<td>P35G-1.5-14C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>35-3846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18324020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM510 META</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation

הגדרת הפצה subcellular של קומפלקסים איתות הכרחי להבנת פלט מורכב. בשיטות המקובלות כגון immunoprecipitation אינם מספקים מידע על לוקליזציה המרחבי של קומפלקסים. לעומת זאת, BiFC מנטר את האינטראקציה מידור subcellular של קומפלקסים חלבונים. בשיטה זו, חלבון fluororescent מחולק ללא פלורסנט שברי אמינו ו-carboxy מסוף אשר התמזגו אז שני החלבונים של עניין. אינטראקציה של תוצאות חלבונים הכינון מחדש של fluorophore (איור 1) 1,2. הגבלה של BiFC היא שברגע fluorophore מקוטעת הוא מחדש המתחם הוא בלתי הפיך 3. מגבלה זו יש יתרון באיתור אינטראקציות חולף או חלש, אבל מונע ניתוח הקינטית של דינמיקה מורכבת. אזהרה נוספת היא כי flourophore מחדש דורש 30 דקות להבשיל לזרוח, שוב מניעת התצפית של אינטראקציות בזמן אמיתי 4. BiFC היא דוגמה ספציפית של assay שבר השלמה חלבון (PCA) המעסיקה חלבונים הכתב כגון ירוק גרסאות חלבון פלואורסצנטי (BiFC), dihydrofolate רדוקטאז, ב-lactamase, ו בלוציפראז למדוד חלבון: אינטראקציות חלבון 5,6. שיטות חלופיות ללמוד חלבון: אינטראקציות חלבון בתאים כוללים העברת הקרינה שיתוף לוקליזציה פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) 7. עבור לוקליזציה משותפת, שני חלבונים מתויגים בנפרד במישרין עם fluorophore או עקיף על ידי immunofluorescence. עם זאת, גישה זו מובילה רקע גבוהה של אי - אינטראקציה חלבונים ולכן קשה לפרש שיתוף לוקליזציה נתונים. בנוסף, בשל מגבלות רזולוציה של מיקרוסקופיה confocal, שני חלבונים עשוי להופיע ללא שותף מקומי בהכרח אינטראקציה. עם BiFC, הקרינה היא נצפתה רק כאשר שני החלבונים עניין אינטראקציה. סריג הוא עוד שיטה מצוינת ללימוד חלבון: אינטראקציות חלבון, אבל יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. סריג ניסויים דורשים את התורם acceptor להיות של בהירות stoichiometry דומים בתא. בנוסף, יש להסביר לדמם דרך של התורם לתוך התעלה acceptor ולהיפך. בניגוד סריג, BiFC יש קצת רקע הקרינה, קצת פוסט עיבוד של נתוני התמונה, אינו מחייב overexpression גבוה, והוא יכול לזהות אינטראקציות חלשות או חולף. תהודה פליטת אור העברת אנרגיה (ברט) היא שיטה דומה סריג פרט התורם הוא אנזים (בלוציפראז למשל) המזרז מצע להפוך bioluminescent מרגש ובכך acceptor. ברט חסרה את הבעיות הטכניות של לדמם דרך הקרינה רקע גבוהה אך חסר את היכולת לספק מידע מרחבי בשל היעדר מצע של לוקליזציה ל 8 תאים ספציפיים. בסך הכל, BiFC היא שיטה מצוינת חזותי לוקליזציה subcellular של קומפלקסים חלבונים כדי לקבל תובנה איתות מידור.

Watch this Scientific Journal Video about Bimolecular Fluorescence Complementation at JoVE.com

Bimolecular Fluorescence Complementation

Subcellular לוקליזציה של חלבונים חשוב בקביעת הרגולציה במרחב ובזמן של איתות התא. כאן אנו מתארים השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) כשיטה פשוטה לניטור אינטראקציות המרחבי של חלבונים בתא.

השלמה Fluorescence bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...