Name: bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2011-04-15T14:00:00
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Il ITSN, PI3K-C2β, e vettori di controllo utilizzati in questo protocollo sono disponibili presso gli autori, su richiesta, per scopi non commerciali solo. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Chang-Deng Hu per la gentile consulenza e dei reagenti utilizzati per stabilire il protocollo BiFC in laboratorio O&#39;Bryan. KAW è stata sostenuta da un finanziamento della Fondazione Jerome Lejeune. Lavoro in laboratorio O&#39;Bryan è sostenuto da finanziamenti della (HL090651) NIH, DOD (PR080428), la Fondazione San Baldrick, e la Fondazione Jerome Lejeune.

A. BiFC calibrazione <ol><li> Scegli un fluoroforo. Fluorofori Ci sono molteplici, come ad esempio YFP e Venere, che funzionano bene come BiFC partner di fusione (Tabella 1). Estremità amino-e carbossi-terminale di Venere sono in grado di formare un complesso a 37 ° C, mentre i frammenti BiFC YFP richiedono una pre-incubazione a 30 ° C al fine di facilitare la formazione di fluoroforo 2. Questo incubazione a bassa temperatura può alterare alcuni processi cellulari e dovrebbero essere pr...

<ol>
	<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation.">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+by+protein+fragment+complementation+strategies.">Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies.</a> Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).</li><li>Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+strategies+to+delineate+MAP+kinase+signaling+pathways+using+protein-fragment+complementation+assays+(PCA).">Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA).</a> Methods. 40, 287-293 (2006).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li><li>Martin, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+regulates+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis,+ubiquitylation,+and+signaling.">Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling.</a> Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).</li><li>Das, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron+survival+through+an+intersectin-phosphoinositide+3'-kinase+C2beta-AKT+pathway.">Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway.</a> Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).</li><li>Mohney, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving.">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li><li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+can+regulate+the+Ras/MAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis.">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li><li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis,+activates+mitogenic+signaling+pathways.">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li><li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogenesis+and+endocytosis:+What's+at+the+INTERSECTIoN?.">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?.</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET.">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li></ol>

BiFC è un metodo eccellente per la visualizzazione di proteine: interazioni proteina nelle cellule intere e determinare la localizzazione subcellulare di questi complessi. I vantaggi di BiFC sono solo le proteine ​​che interagiscono sono fluorescenti, le interazioni transitorie sono stabilizzate, e post-processing dei dati di imaging è minimo. Due gli svantaggi di questo metodo sono il tempo di maturazione per l&#39;fluoroforo e l&#39;irreversibilità del complesso fluoroforo. In alcune applicazioni di questa irre...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>35-011-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matek</td>
<td>P35G-1.5-14C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>35-3846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18324020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM510 META</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation

Definire la distribuzione subcellulare di complessi di segnalazione è fondamentale per comprendere l&#39;output di quel complesso. Metodi convenzionali come immunoprecipitazione non forniscono informazioni sulla localizzazione spaziale dei complessi. Al contrario, BiFC controlla l&#39;interazione e la compartimentazione subcellulare di complessi proteici. In questo metodo, una proteina fluororescent è suddivisa in amino-e carbossi-terminale non fluorescente frammenti che vengono poi fuse per due proteine ​​di interesse. Interazione dei risultati proteine ​​ricostituzione del fluoroforo (Figura 1) 1,2. Una limitazione di BiFC è che una volta che il fluoroforo frammentato è ricostituito il complesso è irreversibile 3. Questa limitazione è vantaggioso nel rilevare interazioni transitoria o deboli, ma esclude l&#39;analisi cinetica di dinamiche complesse. Un ulteriore avvertimento è che il flourophore ricostituito richiede 30 minuti di maturare e di fluorescenza, di nuovo precludendo l&#39;osservazione di interazioni in tempo reale 4. BiFC è un esempio specifico del test di complementazione proteica frammento (PCA), che impiega proteine ​​giornalista come varianti proteina fluorescente verde (BiFC), la diidrofolato reduttasi, b-lattamasi, e luciferasi per misurare le proteine: interazioni proteina 5,6. Metodi alternativi per lo studio delle proteine: interazioni proteina nelle cellule includono fluorescenza co-localizzazione e Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) 7. Per la co-localizzazione, due proteine ​​sono contrassegnati individualmente o direttamente con un fluoroforo o mediante immunofluorescenza indiretta. Tuttavia, questo approccio porta a di fondo di non interagenti proteine ​​che lo rende difficile da interpretare co-localizzazione dei dati. Inoltre, a causa dei limiti di risoluzione della microscopia confocale, due proteine ​​possono apparire co-localizzati senza necessariamente interagire. Con BiFC, fluorescenza è osservato solo quando le due proteine ​​di interesse interagire. FRET è un altro ottimo metodo per lo studio delle proteine: interazioni delle proteine, ma possono essere tecnicamente difficile. FRET esperimenti richiedono il donatore e accettore di essere di luminosità simili e stechiometria nella cella. Inoltre, si deve tenere conto di sanguinare tramite del donatore nel canale accettore e viceversa. A differenza di FRET, BiFC ha poco fluorescenza di fondo, poco dopo l&#39;elaborazione dei dati di immagine, non richiede l&#39;iperespressione alto, e in grado di rilevare le interazioni deboli o transitorie. Risonanza trasferimento bioluminescenza energia (BRET) è un metodo simile a FRET tranne il donatore è un enzima (luciferasi ad esempio) che catalizza un substrato per diventare bioluminescenti così emozionante un accettore. BRET mancano i problemi tecnici di sanguinare attraverso e fluorescenza di fondo alto, ma manca la capacità di fornire informazioni spaziali a causa della mancanza di localizzazione del substrato ai compartimenti specifici 8. Nel complesso, BiFC è un metodo eccellente per la visualizzazione di localizzazione subcellulare di complessi proteici al fine di conoscere segnalazione compartimenti stagni.

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Bimolecular Fluorescence Complementation

La localizzazione subcellulare delle proteine ​​è importante nel determinare la regolazione spazio-temporale di segnalazione cellulare. Qui, descriviamo biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) come un metodo semplice per il monitoraggio delle interazioni spaziali delle proteine ​​all&#39;interno della cellula.

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