Name: establishment and propagation of human retinoblastoma tumors in immune deficient mice
Uploaded: 2011-08-04T13:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice at JoVE.com

המימון לפרויקט זה מתפרסם על ידי קרן קלייטון למחקר קרן מחקר רשתית.

1. הכנת tumorspheres רטינובלסטומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג הגידול מדגם רטינובלסטומה תחת פרוטוקול שאושר-IRB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טרי מוגדר תא גזע התקשורת (Neurobasal-מדיה, 1X B-27 תוסף ויטמין A מינוס, 1X שאינם חיוניים פתרון חומצת אמינו, 1X L-גלוטמין, 20 ng / mL EGF, 10 ng / mL bFGF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחינה מכנית disaggregate רקמת הגידול עם אזמל בטכניקה צולבות חיתוך, סטרילי רקמה תרבות שטופלו 6-גם צלחת. מיד להוסיף 100 μL של התקשורת תא מוגדר גזע לרקמה בעדינות להפיץ את רקמת טחון באמצעות אזמל. הוסף 5 מ&quot;ל של התקשורת תא גזע מוגדרים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתוך חממה humidified ולבדוק מדי יום. Tumorspheres כמה צריך לנבוע רקמת הגידול שיבשו כמעט מיד, עם מספר גדל והולך במשך 2-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבועי, tumorspheres צנטריפוגות ב 300xg במשך 5 דקות, resuspend ב המוכן טרי מדיה תא מוגדר גזע, pipet למעלה ולמטה 10 פעמים לשבש גדול, תחומי נמקי מרכזי ולאפשר חדשים, תחומים בריא הטופס. </li></ol> 2. הכנת תאים סרטניים להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הזרקת tumorspheres תרבותי, תחומי pipet בעדינות לתוך צינורית 15 מ&quot;ל קונית. Pipet בעדינות מעלה ומטה עם pipet סרולוגיות 10-15 פעמים לשבש את התחומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים להיות מוזרק באמצעות hemacytometer ו aliquot לפחות 50,000 תאים לכל הזרקה לתוך צינור חדש. היכונו כמו זריקות רבות ככל האפשר על פי מספר התאים הזמינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 300xg במשך 5 דקות. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend ב 5 מ&quot;ל PBS. חזור צנטריפוגה והשאיפה ו resuspend ב 10 PBS μL לכל זריקה. </li></ol> 3. הכנת בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק אינסולין, לנהל זריקה intraperitoneal של קוקטייל הרדמה מכרסם (קטמין 37.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל, xylazine 1.92 מ&quot;ג / מ&quot;ל, acepromazine 0.38 מ&quot;ג / מ&quot;ל) בשעה μL 1 גרם לכל משקל גוף (gbw). המתן 5 דקות החיה להיות מסומם. בדוק דופק והמקום בעלי חיים על משטח לוהט. שמור על בעלי חיים על משטח לוהט בכל עת עד להחלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרגעה, לנהל ירידה של 1 proparacaine HCl בעין ימין. החלף חיה על כרית מחוממת לחכות 1 דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניהול 1 טיפה של phenylephrine HCl בעין ימין. החלף את חיה על כרית מחוממת לחכות 5 דקות. אם התרחבות של התלמיד לא קרה, מחדש לנהל 1 טיפה לחכות עוד 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעקב אחר סימני חיים של תנועה, או מתעוות, אשר עשוי להתרחש בכל&gt; 30 הדקות שלאחר הרגעה. בשלב הסימנים הראשונים של התנועה, לנהל μL 1 / gbw של קטמין הידרוכלוריד (מדולל ל -10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PBS) ומחכים 5 דקות. </li></ol> 4. הזרקה של תאים סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה הרדים מתחת למיקרוסקופ על צידו, עם עין ימין פונה כלפי מעלה ועם הראש נח על גזה מרוכז כדי להשיג רפלקס אדום בעין ימין הפונדוס (תלמיד צריך להיות מורחבים בשלב זה) כאשר נצפו מבעד למיקרוסקופ . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנכס את העולם ימינה ידי בעדינות לדחוף למטה בו זמנית עם שתי אצבעות על העפעפיים ולהחזיק בעמדה זו בהתמדה עד סוף ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט סטרילית 30-מד מצורף מזרק Luer-מנעול, לחדור את העולם רוחבית דרך לחמית והלחמית סמוך גובלת באזור הקרנית של פלאנה Pars (איור 1), ורק דרך דמית העין לתוך חלל הזגוגית. הסר את המחט מן הפתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את מחט המילטון עם ספוגית אלכוהול. צייר את ההשעיה התא לתוך המזרק המילטון להכניס את המחט לתוך הפתח עד המחט היא דמיינו מבעד למיקרוסקופ מאחורי העדשה בתוך הזגוגית ליד הרשתית. בעזרת אדם נוסף, כשהוא אוחז את המחט בהתמדה במצב זה, לוחץ על המתג לאט. הסר את המחט. במידת הצורך, להשתמש צמר גפן על מנת לספוג את הנוזלים מן הפתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשחרר את הלחץ של העפעפיים כדי לסגור את העפעפיים העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניהול 1 טיפה של hypromellose לכל עין ולחזור חיה לרפד מחומם להתאוששות. </li></ol> 5. ניטור של עכברים שהוזרק והקציר של גידולים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום, לבחון את העין מוזרק עבור leukocoria (לבן papillary רפלקס) ו / או התנפחות periocular כי בדרך כלל מתברר 2-4 שבועות לאחר ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגידול מזוהה, להרדים בעלי חיים בהתאם להנחיות מוסדיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם את העין ואת הגידול מכוסים על ידי העפעפיים, השתמש באזמל לעשות שני חתכים אורתוגונליים אל הסדק palpebral ולהרים את שולי העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת להדמיה באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי, לעשות חתך ההיקפי בבית לימבוס, להסיר את הקרנית ואת העדשה, בזהירות לנתח את עיקר מסת הגידול מן ברקמות אחרות באמצעות תינניותzers. מניחים את הגידול סטרילי RPMI-1640 התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פינצטה לאט למשוך את העולם לפתוח מהשקע. כדי להבטיח את עצב הראייה המצורפת כך הפלישה הגידול ניתן דמיינו, למשוך את הגלובוס עד עצב חשוף ולהשתמש מספריים לחתוך את העצבים כמה שיותר זמן. מקום 10% פורמלין לעיבוד קבוע לבדיקה היסטולוגית. </li></ol> 6. נציג תוצאות: Tumorspheres רטינובלסטומה יתחילו להופיע מן הרקמה disaggregated כמעט מיד כאשר הם משוחררים מסת הגידול. בתוך 2-4 ימים, tumorspheres יותר יתחילו הטופס יגדל בגודל. הכדורים נוטים להיות קבועים התערוכה מוגדרים היטב, קרום משנית המקיפה את המצרף (איור 2). בעלי חיים בדרך כלל מתנות עם leukocoria בתוך 4 שבועות לאחר ההזרקה (איור 3 ב), ואחריו הגדלה של הגלובוס התנפחות של הרקמות הסובבות 5-8 שבועות לאחר ההזרקה כמו הגידול גדל (איור 3c). <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. חתך תרשים של העין העכבר הדגשת תכונות הפניה בפרוטוקול. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. התרבות של תאים רטינובלסטומה אדם במבחנה צילמו בבית) 4x, ו ב) הגדלה 10x אובייקטיבי. העיקרי רטינובלסטומה תאים סרטניים לייצר tumorspheres עם צורה spheroid רגיל הקרום החיצוני פריך. ברים סולם מייצגים) 500 מיקרומטר, ב) 200 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3 עין Rag2 -. / - עכבר מראה) תכונות רגיל, ב) leukocoria מעיד על מסת גידול חלל הזגוגית, ג) מסה הגידול גדול ממלא את העולם עם distension periocular קשור, דימום תוך עיני.

<ol>
	<li>Ch&#232;vez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+and+Nonmetastatic+Models+of+Retinoblastoma.">Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma.</a> Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).</li><li>Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Ch&#232;vez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+consequences+of+intraocular+administration+of+modified+adenoviral+vectors.">Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).</li><li>Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Ch&#232;vez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Transfer+into+Retinal+Cells+Using+Adenoviral+Vectors:+Dependence+on+Receptor+Expression.">Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי מכללת ביילור לרפואה IACUC הוועדה.

הטכניקה המתוארת במסמך זה מאפשר רטינובלסטומה התפשטות גידולים בסביבה התוך עיני, intravitreal שלהם. טכניקת ההזרקה התוך עיני שימש בעבר ליצירת גידולים של רטינובלסטומה הנגזרות שורות תאים 1 וכן לספק וקטורים ויראליים עבור ריפוי גנטי התוך עיני 2,3. טכניקה זו עכשיו נוצלו בהצלחה לייצר גידולי רטינובלסטומה אדם על ידי הזרקה ישירה של תאים מהגידול הראשוני של הזריקה tumorspheres כמו גם התפשטות של גידולים xenograft סדרתי. ראיות גלוי של היווצרות הגידול (בדרך כלל leukocoria) הוא בדרך כלל ציין הראשון בתוך 4 שבועות, לאחר דימום תוך עיני התנפחות של ו הגלובוס / או הרקמות הסובבות את המסלול לפתח בתוך 5-8 שבועות. מיעוט של עכברים שהוזרק לפגוע עין מוזרק, המוביל סגירתו של העפעפיים. במקרים אלה, התנפחות הוא הסימן היחיד של היווצרות הגידול. הקמת גידולים xenograft Murine לא הצליחה עם כל גידולי רטינובלסטומה האדם, אם כי התפשטות של גידולים xenograft הוקמה הוא מוצלח ביותר. תצפית זו מרמזת כי מאפיינים מסוימים של הגידול הראשוני, כגון הפולשנות ורמת בידול או כל גורם ידוע אחר, עשוי להיות השפעה על היכולת של גידולים אלה להתמיד בסביבה עינית Murine. כמות רקמת כי ניתן לרכוש מן הגידול רטינובלסטומה האדם הוא די קטן, ויש מגבלות משמעותיות על היכולת האנושית התרבות תאים במבחנה רטינובלסטומה כגון תוחלת חיים מוגבלת, אובדן היסטולוגיה גידולים מוצקים ושינויים פנוטיפ הסלולר. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה יחסית, כדי להפיץ את הגידול האנושי לבסס מודל Murine של המחלה האנושית. זה מאפשר עוד במבחנה ניסויים vivo של הביולוגיה של רטינובלסטומה והתחזוקה ארוך יותר מחוץ הגידול של המטופל.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג # </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Phenylephrine HCl 2.5% </td><td> Bausch &amp; Lomb </td><td> 053-11 </td><td> עיניים פתרון </td></tr><tr><td> 30-ga מחט </td><td> BD </td><td> 305128 </td><td> רגיל שפוע </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל Luer-Lock מזרק </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 3/10-cc מזרק אינסולין </td><td> BD </td><td> 328431 </td><td></td></tr><tr><td> מטליות אלכוהול </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td></td></tr><tr><td> 6-ובכן, פלייט רקמות תרבות שטופלו </td><td> BD </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Proparacaine HCl 0.5% </td><td> באטלר AHS </td><td> 017239 </td><td> עיניים פתרון </td></tr><tr><td> קטמין HCl 100mg/mL </td><td> Fort Dodge </td><td> 4402A </td><td></td></tr><tr><td> 10-μL המילטון מזרק </td><td> המילטון החברה </td><td> 7648-01 </td><td></td></tr><tr><td> 32-ga המילטון מחט </td><td> המילטון החברה </td><td> 7803-04 </td><td> אורך מותאם אישית - 0.5 &quot; </td></tr><tr><td> Neurobasal-Media </td><td> Invitrogen </td><td> 10888-022 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 בתוספת ויטמין A מינוס, 50X </td><td> Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI-1640 Media </td><td> Mediatech </td><td> 10-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Non-חיוני חומצה אמינו פתרון, 100x </td><td> Mediatech </td><td> 25-025-CI </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין, 100x </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-CI </td><td></td></tr><tr><td> פנויה # 11 איזמל </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td><td></td></tr><tr><td> הרדמה מכרסמים Combo </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> In-בית מרקחת ניסוח (קטמין 37.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל, xylazine 1.92 מ&quot;ג / מ&quot;ל, acepromazine 0.38 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> רקומביננטי הגורם האנושי צמיחה עוריות (EGF) </td><td> STEMCELL טכנולוגיות </td><td> 02633 </td><td> מחדש ב 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מניות פתרון </td></tr><tr><td> רקומביננטי גדילה אנושי בסיסי פיברובלסטים פקטור (bFGF) </td><td> STEMCELL טכנולוגיות </td><td> 02634 </td><td> מחדש ב 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מניות פתרון </td></tr><tr><td> OMS-75 מבצע מיקרוסקופ </td><td> Topcon מערכות רפואיות </td><td> OMS-75 </td><td> מודל זה הופסק </td></tr><tr><td> 10% פורמלין </td><td> VWR </td><td> 95042-908 </td><td></td></tr></tbody></table>

establishment and propagation of human retinoblastoma tumors in immune deficient mice

רטינובלסטומה culturing גידול תאים בתקשורת תא מוגדר גזע מעורר tumorspheres העיקרי ניתן לגדל ומתוחזק לזמן מוגבל בלבד. אלה tumorspheres תרבותי עשוי להפגין פנוטיפים הסלולר שונה במידה ניכרת בהשוואה הגידולים המקוריים. הפגנה כי תאים בתרבית יש את היכולת להרכיב גידולים חדשים חשוב לוודא כי הדגם תאים בתרבית הביולוגיה של הגידול המקורי. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הפצת גידולים רטינובלסטומה אדם in vivo באמצעות Rag2 - / - עכברים חסר החיסונית. Cultured tumorspheres רטינובלסטומה האדם של מעבר נמוך או התאים המתקבלים שנקטפו זה עתה גידולים רטינובלסטומה האדם מוזרק ישירות לתוך חלל הזגוגית של העיניים Murine טופס גידולים בתוך 2-4 שבועות. גידולים אלה ניתן לקצור ואו passaged נוספת לתוך העיניים Murine in vivo או מבוגר כמו tumorspheres במבחנה. רביה בוצעה בהצלחה על לפחות שלושה מעברים ובכך לבסס מקור מתמשך של רקמת רטינובלסטומה אדם לניסויים נוספים. ווסלי ס בונד לאליטה Wadhwa הם שיתוף ואחת מחברי.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice at JoVE.com

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

השיטה מתוארת להפיץ גידולים אנושיים בעכברים רטינובלסטומה. תאים סרטניים הם מוזרק ישירות לתוך עיניו של עכברים חסר החיסונית. גידולים משניים הוקמו בהצלחה הן באמצעות תאים שנקטפו ישירות גידולים אנושיים tumorspheres תרבותי.

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Flexible Colonoscopy in Mice to Evaluate the Severity of Colitis and Colorectal Tumors Using a Validated Endoscopic Scoring System

קולונוסקופיה גמישה בעכברים כדי להעריך את חומרת קוליטיס ומעי הגס גידולים באמצעות מערכת Validated אנדוסקופי ניקוד

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

אינדוקציה של קרצינומה של תאי מעבר שלפוחית ​​השתן פולשנית בMUC1 עכברים הטרנסגניים חיסוניים אנושיים שלמים: מודל לפיתוח חיסוני

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

בדימות אופטי Vivo של גידולים במוח ודלקת פרקים באמצעות פלורסנט SapC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

יצירה אנטומית מדויק והשחזור תוך גולגולת xenografts של גידולים במוח אדם

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

הקמת דגם פגם קריטי בגודל הירך מגזרית עכברים מיוצב על ידי פלייט Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

אינדוקציה של טרשת עורקים מואצת בעכברים: מודל "פגיעת חוט"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...