Name: establishment and propagation of human retinoblastoma tumors in immune deficient mice
Uploaded: 2011-08-04T13:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice at JoVE.com

Финансирование данного проекта осуществляется Клейтон научного фонда и Фонда Retina исследований.

1. Подготовка ретинобластома tumorspheres <ol><li> Получить образец ретинобластома опухоли под IRB, утвержденных протоколом. </li><li> Подготовка свежих определены СМИ стволовых клеток (Neurobasal-медиа, 1X B-27 дополнения минус витамина, 1X несущественные аминокислоты кислоты, 1X L-глутамина, 20 нг / мл ЭФР, 10 нг / мл bFGF). </li><li> Механически дезагрегировать опухолевой ткани с помощью скальпеля использованием сквозной технику в стерильной, культуры тканей обработанных 6-луночный планшет. Сразу же добавить 100 мкл определены СМИ стволовых клеток в ткани и мягко распространению фарш ткани с помощью скальпеля. Добавьте 5 мл определены СМИ стволовых клеток к колодцу. </li><li> Инкубировать при 37 ° C, 5% СО 2 во влажной инкубатор и проверить ежедневно. Некоторые tumorspheres должны вытекать из опухолевой ткани нарушается почти сразу, и все больше в течение 2-4 дней. </li><li> Еженедельно, центрифуги tumorspheres на 300xg в течение 5 минут, ресуспендируют в свежеприготовленный определены СМИ стволовых клеток, и пипетки вверх-вниз 10 раз, чтобы сорвать больше, централизованно некротических сферах, а также позволяет новым, здоровым сфер форме. </li></ol> 2. Подготовка опухолевых клеток для инъекций <ol><li> Если инъекционных культурный tumorspheres, мягко пипетки сферы в 15-мл коническую трубку. Аккуратно пипетки вверх и вниз с серологические пипетки 10-15 раз сорвать сферах. </li><li> Граф клетки для инъекций использованием hemacytometer, и аликвоту не менее 50000 клеток на введение в новую трубу. Подготовка к инъекции, как многие, как возможно на основе числа клеток имеется. </li><li> Центрифуга на 300xg течение 5 минут. Тщательно аспирата супернатант и ресуспендируют в 5 мл PBS. Повторите центрифугирования и стремление, и ресуспендируют в 10 мкл PBS на инъекцию. </li></ol> 3. Подготовка животных <ol><li> Использование инсулиновый шприц, администрирования при введении препарата в грызун коктейль анестезии (кетамин 37,6 мг / мл, ксилазина 1,92 мг / мл, acepromazine 0,38 мг / мл) на 1 мкл на грамм массы тела (GBW). Подождите 5 минут, чтобы животное могло стать седации. Проверьте пульс и место животного на нагретой панели. Поддерживать животных на нагревают площадку в любое время до выздоровления. </li><li> После седации, администрирования 1 каплю раствора для proparacaine правого глаза. Замените животные на подогреваемых блокнот и подождите 1 минуту. </li><li> Администрирование 1 каплю раствора для фенилэфрин правого глаза. Замените животные на площадке подогревом и подождать 5 минут. Если расширение зрачка не произошло, повторно управлять 1 капли и подождать еще 5 минут. </li><li> Монитор животных на наличие признаков движения или подергивания, которые могут возникнуть на&gt; 30 минут после успокоения. При первых признаках движения, управление 1 мкл / GBW кетамина HCl (разбавляют до 10 мг / мл в PBS) и подождите 5 минут. </li></ol> 4. Инъекции клеток опухоли <ol><li> Место под наркозом животных под микроскопом на боку, с правого глаза вверх и с голову на марлю и в центре, чтобы получить красный рефлекс глазного дна правого глаза (ученик должен быть расширенными в это время), когда наблюдается через микроскоп . </li><li> Подоприте право мира, осторожно надавив одновременно с двумя пальцами на веки и держать эту позицию уверенно на оставшуюся часть процедуры. </li><li> Использование стерильных 30-игла прилагается к Луер-Лок шприц, проколоть миру сбоку через конъюнктивы и склеры, прилегающих к роговице лимба в районе Парс-Плана (рис. 1) и только через сосудистую оболочку в полость стекловидного тела. Удалите иглу из отверстия. </li><li> Стерилизуйте иглу Гамильтона с тампоном, смоченным спиртом. Нарисуйте клеточной суспензии в шприц Гамильтон и вставить иглу в отверстие до иглы визуализируется через микроскоп за линзы в стекловидное возле сетчатки. С помощью второго человека, держа иглу постоянно в этом положении, нажмите поршень медленно. Удалите иглу. Если необходимо, используйте ватный тампон, чтобы поглощать жидкости из отверстия. </li><li> Аккуратно релиз давлением веки, чтобы закрыть мыши веки. </li><li> Администрирование 1 каплю гипромеллоза для каждого глаза и вернуть животное подогревом площадкой для восстановления. </li></ol> 5. Мониторинг вводили мышам и уборки опухолей <ol><li> Ежедневно, изучить вводят око за leukocoria (белые папиллярные рефлекс) и / или periocular вздутие, которое обычно проявляется через 2-4 недели после инъекции. </li><li> Как только рост опухолей обнаружен, эвтаназии животных в соответствии с ведомственным руководящим принципам. </li><li> Если глаза и опухоль распространяется век, использовать скальпель, чтобы сделать два разреза ортогональной глазной щели и поднимите кожных лоскутов. </li><li> Под визуализации с помощью стереоскопического микроскопа, делают разрез в окружной лимба, удаление роговицы и хрусталика, и тщательно анализировать основную часть опухоли из других тканей с использованием TweeЦерс. Место опухоли в стерильной среде RPMI-1640 средств массовой информации. </li><li> Используйте пинцет, чтобы медленно потяните открытым миру из розетки. Для обеспечения прилагается зрительного нерва так опухолевой инвазии могут быть визуализированы, тянуть шар до нерва подвергается и использовать ножницы, чтобы вырезать нерва как можно дольше. Место в 10% формалине для регулярной обработки для гистологического исследования. </li></ol> 6. Представитель Результаты: Ретинобластома tumorspheres начнут появляться с разбивкой ткань практически сразу же, как они будут освобождены от опухоли. В течение 2-4 дней, более tumorspheres начнет формировать и будет увеличиваться в размерах. Сферах, как правило, регулярные и имеют четко определенного, среднего мембраны, окружающей агрегат (рис. 2). Животного обычно проявляется leukocoria в течение 4 недель после инъекции (рис. 3б), а затем расширение земной шар и растяжения окружающих тканей через 5-8 недель после инъекции, как опухоль растет (рис. 3в). <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig1.jpg" alt="Рисунок 1"/> Рисунок 1. Поперечного сечения диаграммы мыши глаз подсветка функции, указанные в протоколе. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig2.jpg" alt="Рисунок 2"/> Рисунок 2. Культуры человеческих клеток в пробирке ретинобластома отображаеются) 4x, и б) 10-кратным увеличением цели. Ретинобластома первичные опухолевые клетки производят tumorspheres с регулярной сфероида форму и четкие наружной мембраны. Шкала бары представляют) 500 мкм, и б) 200 мкм. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig3.jpg" alt="Рисунок 3"/> Рисунок 3 Глаз RAG2 -. / - Мыши показывает) нормальные функции, б) leukocoria свидетельствует о опухолевой массы в полость стекловидного тела, и в) большая масса опухоли заполнения миру с соответствующими растяжение periocular, внутриглазное кровотечение.

<ol>
	<li>Ch&#232;vez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+and+Nonmetastatic+Models+of+Retinoblastoma.">Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma.</a> Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).</li><li>Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Ch&#232;vez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+consequences+of+intraocular+administration+of+modified+adenoviral+vectors.">Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).</li><li>Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Ch&#232;vez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Transfer+into+Retinal+Cells+Using+Adenoviral+Vectors:+Dependence+on+Receptor+Expression.">Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).</li></ol>

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Медицинского колледжа Бэйлора IACUC комитета.

Методике, описанной здесь способствует распространению опухоли ретинобластомы в их внутриглазное, интравитреальные среде. Внутриглазного технику инъекции был использован в прошлое, чтобы создать опухоли от ретинобластомы полученных клеточных линий 1, а также для доставки вирусных векторов для генной терапии внутриглазным 2,3. Эта методика была успешно использована для получения человеческих опухолей ретинобластома по прямым впрыском клеток из первичной опухоли и введение tumorspheres, а также серийные распространения ксенотрансплантата опухолей. Видимые свидетельства образование опухолей (обычно leukocoria), как правило, впервые отмечено в течение 4 недель, после чего внутриглазное кровотечение и вздутие земного шара и / или тканей, окружающих орбиту развиваются в течение 5-8 недель. Меньшинство вводили мышам вводили травмировать глаз, что привело к окончательному закрытию век. В этих случаях, вздутие является единственным признаком образования опухоли. Создание мышиных опухолей ксенотрансплантата не была успешной со всеми человеческими опухолями ретинобластома, хотя и распространении раковых опухолей ксенотрансплантата является весьма успешным. Это наблюдение позволяет предположить, что некоторые характеристики первичной опухоли, такие, как инвазивность и уровень дифференциации или другой неизвестный фактор, может быть, влияющих на способность этих опухолей упорствовать в мышиной среды окуляра. Количество ткани, которые могут быть приобретены у человека опухоли ретинобластома весьма мала, и Есть существенные ограничения на способность к культуре человеческих клеток ретинобластомы в пробирке, такие как ограниченный срок службы, потеря твердого гистология опухоли и изменения в клеточной фенотипа. Этот протокол обеспечивает относительно простой способ для распространения опухоли человека и создания мышиной модели заболевания человека. Это позволяет в дальнейшем в пробирке и в естественных экспериментов по биологии ретинобластомы и дольше поддержания опухоли за пределы пациента.

<table border="1"><tbody><tr><th> Имя </th><th> Компания </th><th> Каталог # </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> Фенилэфрин HCl 2,5% </td><td> Bausch &amp; Lomb </td><td> 053-11 </td><td> Офтальмология решение </td></tr><tr><td> 30-га иглы </td><td> BD </td><td> 305128 </td><td> Регулярные конические </td></tr><tr><td> 10-мл Луер-Лок Шприц </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 3/10-cc инсулиновый шприц </td><td> BD </td><td> 328431 </td><td></td></tr><tr><td> Тампоны спиртовые </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td></td></tr><tr><td> 6-луночный планшет, культуры тканей обработанных </td><td> BD </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Proparacaine HCl 0,5% </td><td> Батлер AHS </td><td> 017239 </td><td> Офтальмология решение </td></tr><tr><td> Кетамин HCl 100мг/мл </td><td> Форт Додж </td><td> 4402A </td><td></td></tr><tr><td> 10-мкл Hamilton Шприц </td><td> Компания Hamilton </td><td> 7648-01 </td><td></td></tr><tr><td> 32-га Гамильтон иглы </td><td> Компания Hamilton </td><td> 7803-04 </td><td> Custom длина - 0,5 &quot; </td></tr><tr><td> Neurobasal-Медиа </td><td> Invitrogen </td><td> 10888-022 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Дополнение Минус витамин А, 50X </td><td> Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI-1640 СМИ </td><td> Mediatech </td><td> 10-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Номера для незаменимых аминокислот кислоты, 100X </td><td> Mediatech </td><td> 25-025-CI </td><td></td></tr><tr><td> L-глютамин, 100X </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-ДИ </td><td></td></tr><tr><td> Одноразовые № 11 скальпеля </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td><td></td></tr><tr><td> Combo грызунов Анестезия </td><td> н / </td><td> н / </td><td> Внутренний аптеке формулировке (кетамин 37,6 мг / мл, ксилазина 1,92 мг / мл, acepromazine 0,38 мг / мл) </td></tr><tr><td> Рекомбинантного человеческого эпидермального фактора роста (EGF) </td><td> STEMCELL Технологии </td><td> 02633 </td><td> Развести в 10 мкг / мл раствора акции </td></tr><tr><td> Рекомбинантного человеческого основной фактор роста фибробластов (bFGF) </td><td> STEMCELL Технологии </td><td> 02634 </td><td> Развести в 10 мкг / мл раствора акции </td></tr><tr><td> OMS-75 Операционный микроскоп </td><td> Topcon Medical Systems </td><td> OMS-75 </td><td> Эта модель была прекращена </td></tr><tr><td> 10% формалине </td><td> VWR </td><td> 95042-908 </td><td></td></tr></tbody></table>

establishment and propagation of human retinoblastoma tumors in immune deficient mice

Культивирование ретинобластома опухолевых клеток в определенных СМИ стволовых клеток приводит к первичному tumorspheres которые могут быть выращены и поддерживается только в течение ограниченного времени. Эти культурные tumorspheres могут проявлять заметно различных клеточных фенотипов, когда по сравнению с первоначальной опухоли. Демонстрация того, что культивируемые клетки имеют возможности формирования новых опухолей, важно обеспечить, чтобы культурная модель клетки биологии опухоли. Здесь мы приводим протокол за распространение опухолей человека ретинобластомы в естественных условиях использования RAG2 - / - иммунодефицитных мышей. Искусственный человеческий tumorspheres ретинобластома низкого прохода или клеток, полученных из свежесобранных опухолей человека ретинобластома вводится непосредственно в полость стекловидного тела мышиных глаз форма опухоли в течение 2-4 недель. Эти опухоли могут быть собраны и либо дальнейших пассировать в мышиных глаз в естественных условиях или выращивают как tumorspheres в пробирке. Распространение была успешно проведена, по крайней мере тремя проходами что позволит установить постоянный источник человеческих тканей ретинобластома для дальнейших экспериментов. Уэсли С. Бонд и Лалита Вадхва являются со-первых авторов.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice at JoVE.com

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Метод описан для распространения опухолей человека ретинобластомы у мышей. Опухолевые клетки напрямую вводили в глазах иммунодефицитных мышей. Вторичные опухоли были успешно созданы с использованием как клетки непосредственно найденным опухолей человека и культурной tumorspheres.

Создание и распространение опухолей человека Ретинобластома в иммунодефицитных мышей

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Flexible Colonoscopy in Mice to Evaluate the Severity of Colitis and Colorectal Tumors Using a Validated Endoscopic Scoring System

Гибкая Колоноскопия у мышей, чтобы оценить тяжесть колита и колоректального опухолей возможность использования системы Validated Эндоскопическая Scoring

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Индукция инвазивная карцинома Переходные мочевого пузыря в иммунных интактными человеческими MUC1 трансгенных мышах: модель для иммунотерапии развития

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

В Vivo визуализация пространственного распределения опухолей головного мозга и артрита использованием флуоресцентных SAPC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Костном мозге бедра Стремление в живых мышей

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Создание Анатомически точного и воспроизводимого внутричерепного Ксенотрансплантаты человека опухолей головного мозга

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Создание человека эпителиальных Enteroids и Colonoids из цельной ткани и биопсия

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

Создание Сегментные бедренных критического размера дефекта модели у мышей стабилизированный пластинкой остеосинтеза

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Индукция ускоренного атеросклероза у мышей: модель "Wire-Injury"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro и In Vivo обнаружения Mitophagy в клетки человека и C. Elegans, мышей

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...