Name: mapping and application of enhancer-trap flippase expression in larval and adult drosophila cns
Uploaded: 2011-06-03T13:00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS at JoVE.com

Wij danken een intern fonds van de Universiteit van Oklahoma (tot BZ) en een subsidie ​​van NSF (IOS-1025556, voor BZ en RAB) voor de ondersteuning van TRF, RAB, XP, AAO, MLW, CAS, en dit onderzoek. Een NIH-subsidie ​​(RO1 NS060878, tot BZ) gedeeltelijk ondersteund RAB. RAB erkent een NIH NRSA (T32 NS07292) training subsidie ​​aan Brandeis University, en een NIH-subsidie ​​(RO1 GM21473) uitgereikt aan Jeffrey Hall op Brandeis, ter ondersteuning van de vroege stadia van deze studie. Wij danken Jeffrey Hall voor zijn voortdurende aanmoedigingen voor dit project. Wij danken dr. Kristin Scott voor het verstrekken van ons met de kuip P&gt; Gal80&gt; stam.

1. Drosophila stammen <ol><li> GAL4 bestuurder: GMR-Gal4, die Gal4 uitdrukt in fotoreceptorcellen. </li><li> UAS lijnen UAS-MJD78Q (of UAS-polyQ), die neurale degeneratie veroorzaakt in Gal4-expressie cellen. UAS-GFP, dat GFP uitdrukt in Gal4-expressie cellen. </li><li> FLP lijnen ey-FLP, die FLP uitdrukt in fotoreceptoren en in subsets van hersengebieden. ET-FLPx2 lijnen, die zijn enhancer-trap regels met twee exemplaren van FLP (FLP-IRES-FLP). We hebben gegenereerd ~ 1000 ET-FLP lijnen (Bohm et al.., 2010), waarvan de expressie patronen moeten nog worden gekarakteriseerd. We beschrijven hier de karakterisering van het expressiepatroon van selecteren ET-FLPx2 in de larven en volwassen vlieg centrale zenuwstelsel (CZS). </li><li> FLP verslaggever yw, actine P&gt; CD2&gt; Gal4, UAS-GFP (Pignoni &amp; Zipursky, 1997), die rapporteert het expressiepatroon van ET-FLPx2 door actine P&gt; Gal4, UAS-GFP op FLP-gemedieerde recombinationele excisie van&gt; CD2. </li><li> Twee elkaar aanvullende Gal80-converting tools Tub P&gt; Gal80&gt; (Gordon &amp; Scott, 2009), de flip-out construct, die constitutief Gal80 uitdrukt in alle weefsels gedreven door een sterke tubuline promotor. Bij het FLP-gemedieerde recombinatie, is&gt; Gal80 gedraaid uit en Gal80 uitdrukking wordt beëindigd slechts in ET-FLPx2 expressie weefsels. Tub P&gt; stop&gt; Gal80 (Bohm et al.., 2010), de flip-in construct, die niet Gal80 uiten onder normale omstandigheden. Gal80 uitdrukking is ingeschakeld door de tubuline promotor alleen in ET-FLPx2 expressie weefsels waarin FLP klapt&gt; te stoppen en flips in Gal80. </li><li> Vliegen voor het testen van Forever activiteit in de samengestelde oog GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P&gt; stop&gt; Gal80 (Bohm et al., 2010.), Die heeft degenereren en depigmented ogen. In FLP-expressie fotoreceptorcellen, is polyQ uitdrukking uitgeschakeld na Gal80 flip-in. GMR-Gal4, UAS-polyQ; (. Bohm et al., 2010) bad P&gt; Gal80&gt;, dat de normale ogen heeft. In FLP-expressie fotoreceptorcellen, is polyQ uitdrukking ingeschakeld na Gal80 flip-out. </li></ol> 2. Reagentia Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, 1X), pH 7,4. 4% paraformaldehyde (PFA), verdund in PBS van 16% PFA, EM waardering (Cat # 15710, Electronic Microscopie Sciences, Hatfield, PA) PBT, 1XPBS met 0,1% Triton-X 100 (Sigma) Anti-Elav (mAb, 9F8A9; Developmental Studies Hybridoma Bank, de Universiteit van Iowa), vlekken alle neuronen in Drosophila. Anti-Repo (mAb 8D12; Developmental Studies Hybridoma Bank, de Universiteit van Iowa) vlekken gliale cellen in Drosophila. Alexa 594 kip tegen de muis secundair antilichaam (Invitrogen) 3. In kaart brengen van de expressie patroon van de enhancer-trap FLPx2 lijnen (* kritische stappen) <ol><li> Verzamel maagden vrouwtjes uit de yw, actine P&gt; CD2&gt; Gal4, UAS-GFP lijn en cross naar mannen van de individuele ET-FLPx2 lijnen. De voormalige dient als een GFP reporter voor weefsel expressie van ET-FLP. </li><li> * Prepareer zwervende 3 e instar F1 larven, behouden de CNS (dat wil zeggen, de hersenen en het ventrale zenuw koord, VNC) en het lichaam muur, fix voor een uur in 4% PFA op ijs, was 3X met ijskoude PBS, gevolgd door 3x wassen met PBT. Ontleding <ol><li> Verwijder de zwervende 3 e instar F1 larven en plaats ze in een schone Sylgard schaal (35 mm x 10 mm petrischaal gevuld met 2 gram Sylgard - gemengd volgens de instructies productie). <ol><li> Verwijder voedselresten met penseel </li></ol></li><li> Vul de schaal met ijs-koude 1XPBS en plaats op ijs om de larven verdoven </li><li> Houd de mond haken van een larve met een pincet en pak de cuticula de buurt van de uitbreiding van anterior luchtgat met een andere pincet en pel de cuticula naar de achterkant einde. Het centrale zenuwstelsel zal worden gehecht aan de mond te haken samen met de speekselklieren, darm, en imaginair schijven. </li><li> Verwijder het overtollig weefsel en imaginaire schijven rondom het centraal zenuwstelsel. </li><li> Overdracht van de CNS in een PBS-gevulde 3 goed pyrex schotel. <ol><li> Een gesiliconiseerde P200 pipetpunt kan gebruikt worden om te voorkomen dat het drogen van het weefsel. </li></ol></li><li> Fix voor 1 uur in 200 ul van 4% PFA op ijs. <ol><li> Zorg ervoor dat de CNS volledig wordt ondergedompeld in de PFA. <ol><li> Als de CNS drijvers, suggereert dit meestal dat het centrale zenuwstelsel niet goed gereinigd van het omringende weefsel. </li></ol></li></ol></li><li> Was 3X met ijskoude PBS, gevolgd door 3x wassen met PBT. </li></ol></li><li> * Ontleden de CNS van volwassen F1 vliegen. <ol><li> Verdoven de vliegen met CO 2 of plaats de vliegen die in een leeg flesje op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Plaats volwassen vliegen in een 95% EtOH gevulde glazen schaal op ijs gedurende 30 sec. </li><li> Breng de volwassen vliegen in een 1XPBS gevulde glazen schaal op ijs. <ol><li> Was 3X met ijskoude 1X PBS om de resterende EtOH te verwijderen </li></ol></li><li> Plaats een vlieg in een 35mm Sylgard schaal gevuld met ijskoud 1X PBS </li><li> Plaats de buikzijde naar boven en steek een klein insect pen (minutiens pins 0,1 mm) halverwege de buik. <ol><li> Met behulp van een tang houden de basis van de benen en verwijder de benen met een ander paar pincetten. </li></ol></li><li> Verwijder de kop cuticula <ol><li> Terwijl grijpen de proboscis met een pincet, een andere plaats onder het oog en schil de cuticula de richting van de dorsale middellijn van de vlieg hoofd. </li><li> Pak het andere oog en verwijder de resterende cuticula aan de andere kant. </li><li> Met behulp van scherpe pincet en / of aangescherpt wolfraam naald, verwijder tracheale weefsel rondom de hersenen <ol><li> Verkeerd reinigen van de trachea zal resulteren in een sterke auto-fluorescentie, belemmeren GFP expressie, en laat de hersenen te zweven tijdens de vaststelling </li></ol></li></ol></li><li> VNC Dissection <ol><li> Verwijder de thoracale cuticula <ol><li> Vanaf het achterste einde van de thorax, plaats twee tangen aan elke zijde van de 3 e preepisternum (dat wil zeggen, grijpen de basis van de achterpoten). </li><li> Voorzichtig los van de cuticula uit de buurt van de ventrale middellijn lijn, herhaal dit tot je bij de basis van de hals. </li><li> Duw de twee helften van de borstkas cuticula het blootstellen van de VNC </li></ol></li><li> Volgende Verwijder de buik van de thorax. Hoewel het gebruik van een tang om de borstkas te houden bij de tweede poot basis, gebruik dan een andere pincet om de buik bij de 1e buik sternite grijp en trek de buik uit te schakelen. </li><li> Om de VNC te verwijderen uit de omliggende thoracale weefsel. Houd de humerus gebied met een pincet en met een andere pincet zachte traan weg het grootste deel van de thoracale karkas. </li><li> Op dit punt moet er een ring van bindweefsel rondom de cervicale bind (nek) zijn. Met behulp van twee tangen uit elkaar scheuren van de ring. </li><li> Verwijder eventuele overtollige thoracale weefsel rondom de VNC </li></ol></li><li> Overdracht van de hersenen en VNC tot 9-goed pyrex schotel met 1X PBS op ijs <ol><li> Een gesiliconiseerde P200 pipetpunt kan gebruikt worden om te voorkomen dat het drogen van het weefsel </li></ol></li></ol></li><li> * Fix de volwassen CNS gedurende 1 uur in 4% PFA op ijs en was 3X met ijskoude PBS en 3x met PBT. </li><li> Incubeer de volwassen CZS voorbereiding of de larvale CZS en het lichaam muur bij 4 ° C gedurende de nacht met antilichamen om ofwel neuronen (anti-Elav, 01:10) of glia (anti-Repo. 1:10). Was de voorbereiding 5x met PBT. </li><li> Incubeer met volwassen of larvale voorbereiding met Alexa 594 kip tegen de muis secundair antilichaam (1:100) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, en was de voorbereiding met PBS. </li><li> Monteer de larven of volwassen CZS op een dia. Voor het behoud van de natuurlijke vorm van het centrale zenuwstelsel, gebruik dan een O-vormige plastic ring (Clear Versterking Label, Avery Dennison, Office Products, Brea, CA) op de dia als een mini-brug naar het dekglas te schorten. </li><li> Onderzoek de voorbereiding voor GFP en Elav (of Repo) expressie patronen onder een fluorescentiemicroscoop. </li></ol> 4. De toepassing van twee complementaire Gal80-converting tools in repressie Gal4 in fotoreceptoren <ol><li> Flippen Gal80 plaats via bad P&gt; Gal80&gt; (figuur 5A). <ol><li> Verzamel mannetjes van de GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P&gt; Gal80&gt; lijn. Merk op dat de samengestelde ogen normaal zijn in deze vliegen. </li><li> Mate met ey-FLP maagden. </li><li> Verzamel de F1 vliegen en onderzoekt het oog fenotype. </li></ol></li><li> Flippen Gal80 in via bad P&gt; stop&gt; Gal80 (Figuur 5B). <ol><li> Verzamel GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P&gt; stop&gt; Gal80 mannelijk vliegen en onderzoekt het oog fenotype. Let op de gedegenereerde en gedepigmenteerde ogen in deze vliegen in vergelijking met wild-type stammen (Canton-S) </li><li> Mate met ey-FLP maagden; </li><li> Verzamel de F1 vliegen en onderzoekt het oog fenotype. </li></ol></li><li> Selecteer ET-FLPx2 lijnen met expressie in fotoreceptorcellen </li></ol> Stappen 4.1 en 4.2 kunnen worden herhaald met ET-FLPx2 lijnen die uitdrukken Forever in een subset van fotoreceptorcellen. Als alternatief, ofwel de GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P&gt; stop&gt; Gal80 vliegt of de GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P&gt; Gal80&gt; vliegen kunnen worden gekruist om individuele ET-FLPx2 lijnen voor het screenen op lijnen die te uiten FLP in fotoreceptorcellen. Waardevolle ET-FLPx2 lijnen zijn die enige uitdrukkelijke Forever in een subset of enkel fotoreceptorcellen (Figuur 6). 5. Representatieve resultaten De expressie patroon van een specifiek ET-FLPx2 lijn kan gemakkelijk worden onderzocht en gedocumenteerd in de F1 larven of volwassen vliegen afgeleid van de kruising tussen yw, actine P&gt; CD2&gt; Gal4, UAS-GFP maagden en ET-FLPx2 mannen (figuur 1) . Typisch, drie tot vijf herhalingen van de F1-dieren worden ontleed en onderzocht om de reproduceerbaarheid van de FLP expressiepatroon (Bohm et al.., 2010) te bepalen. <strong&gt; Figuur 2 toont de expressie patroon van Forever in ET-FLPx2 lijn 173A in het larvale en volwassen CZS. De FLP patroon kan verder worden geanalyseerd met behulp van een neuronale gliale of marker (figuur 3 &amp; 4). De resultaten weergegeven in Figuur 7 illustreert de effectiviteit van Gal80 flip-in en flip-out systemen in intersectionele repressie van Gal4 volgende FLP-gemedieerde recombinatie. De kuip P&gt; stop&gt; Gal80 bouwen lijkt niet aan een lekkende uitdrukking van Gal80 (op basis van de uniforme degeneratie en depigmentatie van de fotoreceptoren) hebben, en toch is het 100% effectief in flipping Gal80 in met de hulp van eyFLP te onderdrukken GMR- GAL4 en het herstel van het oog naar de normale optredens (fig. 7A). Integendeel, bad P&gt; Gal80&gt; volledig onderdrukt GMR-Gal4 vóór de invoering van de eyFLP. Volgende Gal80 flip-out,, GMR-Gal4 drives UAS-polyQ expressie leidt tot degenereren en depigmented ogen (Fig. 7B). In dit voorbeeld hebben we gebruik gemaakt van een pan-photorecetor Forever voor de fotoreceptor &#39;circuits&#39; kaart, maar niet onderzoekt de gedragsmatige gevolgen. Met behulp van een soortgelijke aanpak met gedragsmatig relevante Gal4 lijnen, hebben we in kaart gebracht deel van de CCAP-Gal4 circuit reguleren vleugel expansie in volwassen vliegen (Bohm et al.., 2010). Wij zijn van mening dat de FINGR methode zal waardevol zijn in het helpen ons begrip van de neuronale basis van gedrag. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. . Onderzoekt het expressiepatroon van een ET-FLPx2 line De FLP expressie patroon (blauwe ovalen) van een ET-FLPx2 lijn kan worden bepaald door kruising van een ET-FLPx2 man (linksboven) met een actine P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS- GFP maagd (rechtsboven). Ubiquitous Actin P&gt; Gal4 uitdrukking in het ouderlijk vrouw wordt gehinderd door het invoegen van de FRT (grijze driehoeken) geflankeerd CD2 volgorde. In de F1 nakomelingen, Forever zal accijnzen de CD2 serie, waardoor Actin P&gt; Gal4 aan UAS-GFP expressie rijden. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Expressiepatroon van een ET-FLPx2 lijn in het larvale en volwassen centrale zenuwstelsel. Deze beelden tonen het CNS (hersenen en ventrale zenuw koord, VNC) ontleed van de nakomelingen van de kruising yw, actine-P&gt; CD2&gt; Gal4, UAS-GFP ouders om de ET-FLPx2 173A lijn. Door recombineren de&gt; CD2&gt; cassette, FLP activeert actine P&gt; GAL4 expressie (de daaruit voortvloeiende uitdrukking van UAS-GFP). Vandaar dat de GFP patroon rapporten FLP-expressie brengende cellen. Paneel A toont de larvale FLP expressiepatroon terwijl paneel B geeft de volwassen expressiepatroon in de lijn 173A. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> Figuur 3. Karakterisering van celtypen die flippase uiten in ET-FLPx2 Line # 688A. A, A samengestelde afbeelding van een vaste F1 3 e instar larve gekleurd met anti-REPO uit een kruising tussen ET-FLPx2 regel # 688A en een GFP Flippase meldlijn. BD, Een hoge vergroting (Zeiss Plan-Apochromat 63x olie) opvatting van de achterste einde van een VNC uit een 3 e instar larven. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="Figuur 4"/> Figuur 4. Karakterisering van celtypes in het lichaam van de paddestoel ET-FLPx2 Line # 150. AC, Een hoge-vergroting afbeelding (63x olie-immersie) van de paddestoel lichaam van een vaste F1 3e instar larve gekleurd met anti-repo. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="Figuur 5"/> Figuur 5. Illustratie van Gal80 Flip-in en Flip-out Strategies. A. In de flip-out strategie, tubuline promotor-driven Gal80 (Tub P&gt; Gal80&gt;) is constitutief actief, wat resulteert in de onderdrukking van GMR-Gal4 en een wild-type eye fenotype (rode ogen). Deze repressie wordt verwijderd door de introductie van FLP (paars), die Gal80 out (midden, rood) flip en laat GMR-Gal4 naar UAS-polyQ uitdrukking rijden. Dit resulteert in fotoreceptorcel degeneratie (geïllustreerd door witte stippen in het oog). B. In het omgekeerde van de vorige strategie, is tubuline promoter-driven Gal80 uitdrukking onderbroken door FRT (grijze driehoek) geflankeerd &quot;stop&quot; stopcodon. Bij het ontbreken van Gal80, GMR-Gal4 bindt aan UAS-polyQ waardoor neuronale degeneratie in fotoreceptoren (geïllustreerd door witte stippen in het oog). Door het kruisen van de GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P&gt; stop&gt; GAL80 mannen met maagdelijke vrouwtjes die FLP te drukken in de fotoreceptorcellen, FLP (paars) zal recombinatie katalyseren op de FRT sites, weg te snijden van de &quot;stop&quot; codon (midden, rood), waardoor voor Gal80 expressie en onderdrukking van GMR-Gal4. Deze behoudt zich het neurodegeneratie in fotoreceptorcellen (geïllustreerd door het ontbreken van wHite stippen in het oog). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="Figuur 6"/> Figuur 6. De toepassing van de methode in FINGR flipping Gal80 met behulp van ET-FLPx2 Line # 688A F1 nakomelingen van een kruising tussen ET-FLPx2 regel # 688A maagd voor GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP&gt; GAL80 man. Het ontbreken van pigment in het midden van het oog ommatidia vertegenwoordigt FLP uitdrukking in regel # 688A. In dit gebied Gal80 onderdrukking van de GMR-Gal4 was opgelucht waardoor de Gal4 om UAS-polyQ rijden. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="Figuur 7"/> Figuur 7. De toepassing van de methode in FINGR omkeren Gal80 in of uit om Gal4 snijden in fotoreceptoren. A. De kuip P&gt; stop&gt; Gal80 flip-in systeem beperkt GAL4 uitdrukking in een Forever-afhankelijke manier. In GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P&gt; stop&gt; GAL80 vliegt, fotoreceptorcellen zijn gedegenereerd en pigmentloze (links vliegen). Na de introductie van eyFLP, is Gal80 uitgedrukt in fotoreceptorcellen, wat resulteert in volle repressie van de GMR-Gal4, die op zijn beurt schakelt de uitdrukking polyQ en produceert vliegt met normale ogen (rechts vliegen). B. De kuip P&gt; Gal80&gt; flip -out systeem werkt in de tegenovergestelde manier als de kuip P&gt; stop&gt; Gal80 flip-in systeem. Tub P&gt; Gal80&gt; constitutief onderdrukt GAL4 en onderdrukt de uitdrukking van polyQ (links vliegen, met normale ogen). Na de introductie van eyFLP, is Gal80 gedraaid uit fotoreceptorcellen, het verlichten van de onderdrukking van de GMR-Gal4 en het draaien op de expressie polyQ. Dit leidt tot vliegt met degenereren en depigmented ogen (rechts vliegen).

<ol>
	<li>Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Cox, L. W., Henry, L. G., Gunter, T. C., Bao, H., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+mosaic+approach+for+neural+circuit+mapping+in+Drosophila.">A genetic mosaic approach for neural circuit mapping in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 16378-16383 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bruno, B., Holbro, N., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+genes+are+required+for+neural+stem+cell+survival+in+postembryonic+neurogenesis+of+Drosophila.">Polycomb group genes are required for neural stem cell survival in postembryonic neurogenesis of Drosophila.</a> Development. 134, 1091-1099 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. , 34-341 (2002).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila.">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302, 1765-1768 (2003).</li><li>Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+tissue+specific+transgene+expression+system+using+inducible+GAL4.">A conditional tissue specific transgene expression system using inducible GAL4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).</li><li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Drosophila+eye+development+by+decapentaplegic.">Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li><li>Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[Switch],+a+system+for+spatial+and+temporal+control+of+gene+expression+in+Drosophila+melanogaster.">P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 12602-12607 (2001).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li></ol>

Het Gal4/UAS systeem is op grote schaal en met succes gebruikt door Drosophilists voor diverse biologische studies (Brand &amp; Perrimon, 1993; Duffy, 2002). Tot op heden heeft de vlieg gemeenschap gegenereerde duizenden promoter-gedreven en enhancer-trap Gal4 lijnen. Een belangrijke kracht van de FINGR methode is dat het compatibel is met het Gal4/UAS-systeem, waardoor het mogelijk aanzienlijk uit te breiden van de kracht van Gal4 in Drosophila studies. Een belangrijke toepassing van de FINGR methode is te fine-tunen neurale circuits die ten grondslag liggen gedrag door Gal4/Gal80 kruispunt. Deze gedragingen kunnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, leren en geheugen, verkering, slaap en circadiane ritme. De FINGR methode kan ook gebruikt worden om de kritische neuronen die gevoelig zijn voor neurodegeneratie in het modelleren van de mens neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer, amyotrofische lateraal sclerose (ALS), en de ziekte van Parkinson kaart. Evenzo kan brandpunten van neuronen of neurale circuits van cruciaal belang voor het bemiddelen cocaïne, alcohol en andere verslaving in kaart worden gebracht met behulp van de FINGR methode. Opgemerkt moet worden dat voorwaardelijke Gal4s (Osterwalder et al., 2001;.. Roman et al., 2001) kan worden gebruikt met de FINGR methode om tijdelijke controle van neurale circuits en gedrag te krijgen. Wijziging van de Gal80-omzetten van tools met behulp van een temperatuur-gevoelige Gal80 (Gal80 ts, McGuire et al.., 2003) kan produceren bad P&gt; stop&gt; Gal80 ts of bad P&gt; Gal80 ts&gt;, het toevoegen van meer tijdelijke flexibiliteit in het circuit manipulatie. Buiten het zenuwstelsel, de FINGR methode is ook van toepassing op het beperken van Gal4 expressie in subsets van cellen of het de vleugel of het been. De ET-FLPx2 lijnen zullen een waardevolle bron voor alle Drosophila biologen geïnteresseerd zijn in FRT / FLP-based klonale analyse (Xu &amp; Rubin, 1993), inclusief MARCM (Lee &amp; Luo, 1999). Ook wordt verwacht dat sommige ET-FLPx2 lijnen kunnen heatshock-FLP te vervangen voor de productie van reproduceerbare klonen en voor herhaalde morfologische en gedrags-analyses. Net als enhancer-trap Gal4 lijnen, de meeste ET-FLPx2 lijnen zijn waarschijnlijk specifiek worden uitgedrukt in de cellen van een belang. De meeste lijnen zullen uitdrukken FLP in de cellen van belang en in andere cellen of weefsels ook. Echter, zal het ontbreken van &#39;weefsel specificiteit&#39; van zowel Gal4 en ET-FLPx2 niet een grote zorg voor de FINGR methode zo lang als hun overlappende regio is wenselijk voor een bepaald experiment. FINGR is ontworpen om twee &#39;brede&#39; systemen om te zetten in een verfijnd is. De methoden geïllustreerd in deze protocollen zijn vrij standaard en moeten worden overgedaan. De belangrijkste waarschuwing stappen die de aandacht behoeven zijn de selectie en het gebruik van het fixeermiddel. Fixatieven andere dan de PFA moet worden vermeden omdat ze GFP signaal lessen. We hebben ook opgemerkt dat de dissectie schotel niet mag worden gebruikt voor de fixatie met PFA de mogelijkheid dat Forever uitdrukking niet betrouwbaar kan worden gerapporteerd door GFP te vermijden.

mapping and application of enhancer-trap flippase expression in larval and adult drosophila cns

De Gal4 / UAS binaire methode is krachtig voor gentherapie en neurale circuits manipulatie in Drosophila. Voor de meeste neurobiologische studies, echter, Gal4 uitdrukking is zelden weefsel-specifiek genoeg om voor een nauwkeurige correlatie van het circuit met gedragsproblemen uitlezingen. Om dit belangrijke hindernis, hebben we onlangs ontwikkelde de FINGR methode om een ​​meer restrictieve Gal4 uitdrukking in het weefsel van belang te bereiken. De FINGR methode bestaat uit drie onderdelen: 1) het traditionele Gal4/UAS systeem, 2) een set van FLP / FRT-gemedieerde Gal80 het omzetten van tools, en 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). GAL4 wordt gebruikt om de primaire neurale circuits van belang te definiëren. Paring de Gal4 met een UAS-effector, zoals de UAS-MJD78Q of UAS-Shi ts, regelt de neuronale activiteit, die op zijn beurt manifesteert zich door veranderingen in de vlieg gedrag. Met een extra UAS-reporter, zoals UAS-GFP, de neurale circuit betrokken zijn bij het specifieke gedrag kunnen gelijktijdig worden in kaart gebracht voor morfologische analyse. Voor Gal4 lijnen met een brede expressie, kan Gal4 expressie worden beperkt met behulp van twee complementaire Gal80-converting tools: tub P&gt; Gal80&gt; (&#39;flip out&#39;) en bad P&gt; stop&gt; Gal80 (&#39;flip in&#39;). Ten slotte kunnen de onderzoekers zet Gal80 aan of uit, respectievelijk, met de hulp van weefsel-specifieke ET-FLP. In de flip-in mode, Gal80 zal Gal4 uitdrukking waar Gal4 en ET-FLP kruisen onderdrukken. In de flip-out modus, zal Gal80 verlichten Gal4 repressie in cellen waarin Gal4 en FLP elkaar overlappen. Beide benaderingen kunnen de beperking van het aantal cellen in de Gal4 gedefinieerde circuits, maar in een omgekeerde patroon. De FINGR methode is compatibel met de uitgebreide collectie van Gal4 lijnen in het vliegen gemeenschap en zeer veelzijdig voor de traditionele klonale analyse en voor de neurale circuit in kaart brengen. In dit protocol, we zien het in kaart brengen van het FLP expressie patronen in een beperkt aantal ET-FLPx2 lijnen en de effectiviteit van de methode in FINGR fotoreceptorcellen. Het principe van de FINGR methode moet ook gelden voor andere genetische model organismen waarvan Gal4/UAS, Gal80, en FLP / FRT worden gebruikt.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS at JoVE.com

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Beschrijven we een Flippase-geïnduceerde intersectionele Gal80/Gal4 repressie (FINGR)-methode, waardoor weefsel-specifieke Forever om Gal80 expressiepatronen te bepalen. Waar Gal4 en FLP elkaar overlappen, is Gal4 uitdrukking ingeschakeld (Gal80 omgedraaid out) of uit (Gal80 gespiegeld in). De FINGR methode is veelzijdig voor klonale analyse en neurale circuit in kaart brengen.

In kaart brengen en de toepassing van Enhancer-trap Flippase Expression in larvale en volwassen Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualisatie van larvale Segmentale zenuwen in 3 Rd Instar Drosophila Larvale Voorbereidingen

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting bulbus olfactorius Neuronen gebruik van Gecombineerd In Vivo Elektroporatie en Gal4-Based Enhancer Trap zebravis Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissectie en Immunohistochemie van larven, popstadium en Volwassen<em&gt; Drosophila</em&gt; Netvliezen

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Functionele Beeldvorming van de auditieve cortex in volwassen katten met behulp van High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Functionele analyse van de larvenvraat Circuit in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Overname van hoge kwaliteit digitale video van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven en volwassen gedrag van een Lateral Perspectief

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Met behulp van Linear Agarose kanalen om te studeren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...