Name: procedure for lung engineering
Uploaded: 2011-03-08T12:00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Lung Engineering at JoVE.com

Vi tackar Maegan B. Colehour för hjälp med bioreaktor utveckling. Dessa studier har finansierats av Yale universitet Institutionen för anestesi och NIH bidrag HL 098.220 (till LEN). THP fick stöd av NIH T32 GM007171.

1. Bioreaktor Assembly Detaljerad bild (er) i bioreaktor konstruktion och montering för både decellularization och kultur ges i figur 1 och 2, respektive. Alla komponenter måste steriliseras före monteringen av bioreaktor. Följande särskilda punkter noteras: ANSLUTNINGAR: <ol><li> Den arteriella kanylen består av en luer-lock passande ansluten till en Y-splitter med en kort segment av slang. Den luer-lock-kontakten är ansluten till perfusion slang, och den del av Y som inte är sys till lungpulsådern är ansluten till en en-vägs ventil. Det envägsventil är orienterad så att vätskan kan dras upp i slangen (i motsatt riktning som perfusion), men under orgel perfusion alla medel rinner ut i lungan. </li><li> Den luftrör kanylen består även av en luer-lock-kontakten kopplad till en Y-splitter med slang. Den luer-lock ansluts till en andning slinga mellan luftstrupen reservoaren och de viktigaste kammaren. Segmentet av Y-kontakten som inte sys fast i luftstrupen är även ansluten till en enkelriktad ventil. Det envägsventil är orienterad på samma sätt som den arteriella kanylen. </li></ol> FUNKTIONER: <ol start="3"><li> Den enkelriktade ventiler i de arteriella och luftstrupen kanyler används för att rensa luftbubblor i slangen genom att möjliggöra återföring av flödet i slangen och därför tillåter luftbubblor tas bort. </li><li> Den &quot;andas loop&quot; inkluderar två enkelriktade ventiler, placeras så att mediet följer en annan väg till och från lungan. En mer detaljerad beskrivning av denna funktion finns i en tidigare publikation från vårt laboratorium 2. </li><li> Vaskulär genomblödning ges med hjälp av en rulle pump. Medium är perfusion i lungartären via bifogade kanyl, flyter genom lungan kärlsystemet, och ut genom lungorna ven direkt i främsta bioreaktor, där mediet är upprättas för perfusion. </li></ol> 2. Organ Harvest <ol><li> Euthanize vuxna (3-6 månader gamla) Fischer 344 råttor av natrium pentobarbital överdos, enligt riktlinjer som anges av American Veterinary Medical Association (60 mg / kg IP). Obs: pentobarbital lösning innehåller heparin vid 100 enheter / ml för antikoagulation. </li><li> Spray eller torka av bröstet och buken med 70% etanol. </li><li> Öppna brösthålan, utsätta hjärta och lungor, var noga med att inte skada lungorna. Försiktigt göra ett litet fönster genom membranet in i brösthålan, vilket gör att lungorna att dra tillbaka, och sedan utöka detta snitt horisontellt att avslöja grunderna i lungorna. Gör två snitt vertikalt genom revbenen, och dra bröstet buren att exponera hjärta och lungor. </li><li> Förbered ett system gravitation perfusion, dvs med hjälp av en spruta med kolv avlägsnas, en 3-vägs kranen, och ~ 20cm i slang med en 1.5inch, 21-gauge nål. Behåll sprutan på ~ 20cm ovanför djuret med hjälp av en ring stativ. Se till att all luft tas bort från perfusion slangen. </li><li> Skär höger förmak rinna blod, hindrar den från att återvända till lungorna. Kapning vänster förmak för att ge enkel dränering av blod och perfusatet från lungorna kan också vara till hjälp, men är inte nödvändigt. </li><li> Stick in nålen i botten av höger kammare och öppna kranen för att BEGJUTA lungorna med en lösning av heparin och natriumnitroprussid (50U/ml och 1ug/ml respektive) i PBS. Kontrollera att lungartären fylls med perfusion vätska, och att blod är clearing från lungorna. Om det behövs fylla på perfusionen sprutan med ytterligare vätska. Typiskt bara ~ 10ml krävs. </li><li> Fortsätt perfusion tills lungorna är tydliga i blod, sedan stoppa perfusion. </li><li> Dissekera luftstrupen fri, upp i halsen så långt som möjligt. Se till luftstrupen är separerad från matstrupen. Dissekera alla återstående anslutningar till hjärta, lungor och luftstrupe, och ta bort i klump. </li><li> Med hjälp av en skalpell eller vass sax, skär av toppen av hjärtat, utsätta höger och vänster kammare. </li><li> Cannulate lungorna stammen via höger kammare, och sutur på plats. Ta bort överflödigt vänsterkammarfunktion vävnad. </li><li> Cannulate luftstrupe och sutur på plats. Se till att både trakeala och pulmonell arteriell kanyler är placerade så att det inte finns någon vridstyv stress på luftstrupe, lungor, eller de stora blodkärlen (figur 1). </li><li> Se till att det inte finns några luftbubblor i arteriella kanylen, eftersom luftbubblor fastnar i systemet kan förhindra konstant flöde av genom orgel. I vissa fall kan en luftbubbla helt stoppa vätska flow.To åstadkomma detta genom att placera hjärt / lung-block i en burk som innehåller PBS. Använd en spruta med nål för att injicera en liten mängd PBS in i hjärtat kanylen att utvisa eventuella bubblor. </li><li> Lavage luftvägarna med PBS 4-5 gånger, att ta bort så mycket luft som möjligt ur lungan. </li><li> Efter lavage stegs är klar, blåsa upp lungorna med PBS innehållande natriumnitroprussid (SNP) vid 1ug/ml. Sätt en propp i luftrör kanylen, så förblir lösningen i lungan. Låt lungan att inkubera i upp till 30 minuter, då samma lösning strömmar genom kärlsystemet via lungartären, för att möjliggöra vasodilatation. </li><li> Anslut hjärta / lungor till en bioreaktor mössa med luer-lock-anslutningar kopplade till Y-formade kanyler, som beskrivs i &quot;Bioreaktor Assembly&quot; ovan. (Figur 1). </li></ol> 3. Organ Decellularization <ol><li> Anslut den gemensamma jordbrukspolitiken (med lungor bifogas) till decellularization apparater (Figur 1). Lungartären kanylen bör ansluta till perfusion linje och luftrör kanylen skall flyta fritt. Se till att alla linjer är klara luft. Som beskrivits ovan, kan luft i ledningarna vara en källa till dåligt decellularization genom att förhindra flöde av decllularization vätska. Luft instängd i systemet kan också finnas kvar i kulturen tid, då det kan ha en negativ inverkan på cellöverlevnad 3. </li><li> Fyll lungorna med PBS / SNP tills lungorna är fulla, men inte överdrivet uppblåsta. Omedelbart cap tracheal kanyl så att lungan är uppblåst. </li><li> BEGJUTA lungorna med PBS / SNP i minst 15 min på ~ 15 mm Hg (20 cm H 2 O tryck). Efter 15min eller längre, ta bort proppen ur tracheal kanyl så att lungorna töms på luft. </li><li> Fortsätt perfusion med PBS / SNP för 30min. Om det behövs för att fylla på PBS / SNP se perfusionstryck hålls på 10-15 mmHg. </li><li> Börja perfusion med decellularization lösning (8mm käkar, 1M NaCl, 25mm EDTA i 1X PBS). Var noga med att alla linjer är klara luft. Ett vakuumsystem kan vara till hjälp för att ge sug. </li></ol> BEGJUTA med decellularization lösning tills 500ml lösning har perfusion genom lungan. Optimalt tryck är &lt;15 mmHg (~ 20 cm H 2 O). Detta vanligtvis kommer att kräva 2,5 timmar. Flöden är vanligtvis mycket långsam (0.2-0.5ml/minute) initialt, och snabbt öka under den andra timmen till ca 1ml/minute eller större. Periodvis bort används decellularization vätska från bioreaktor, vilket garanterar tillräckligt med vätska återstår att stödja lungorna och luftrör kanyl. 4. Orgel sköljning och sterilisering <ol><li> Överföring lunga och bioreaktor till en vävnadskultur huva. Börja sköljning med steril PBS genom att ta bort 500ml burk som innehöll decellularization vätskan och ersätta med en steril burk innehåller upp till 1L av sterila PBS. Använd vakuumsug för att se linjer är klara luft. </li><li> BEGJUTA PBS via kärlsystemet till 10-15 mmHg, på samma sätt som för decellularization. Periodvis bort avfall PBS från bioreaktorn och ersätta och / eller fylla på PBS burken med färsk, steril PBS. Det är tillrådligt att använda steril teknik. </li><li> Fortsätt att skölja tills minst 2,5 L sterilt PBS har perfusion lungan. </li><li> Överför lunga till en ny, steril bioreaktor system som innehåller färska PBS. Kontrollera att både hela perfusion slingan och hela linjer luftvägarna är fyllda med vätska. Alla efterföljande steg kommer att använda en pulserande pump för att BEGJUTA lungorna vid 5ml/min. </li><li> Sterilisera schavotten, antingen via natten perfusion med PBS + 10% FBS + 10% pen-strep lösning eller i 3 timmar med 0,1% perättiksyra i PBS. Det senare kräver att skölja lungorna med 3 byten av 250ml PBS under flera timmar för att avlägsna rester av syra. För varje sköljning bör lungan ventileras liksom perfusion för att säkerställa att alla delar av vävnaden sköljs ordentligt. </li><li> Överför lungan till en 37 ° C inkubator och BEGJUTA med PBS som har 10% FBS och 10% penicillin / streptomycin för ~ 1 timme eller tills temperaturen är jämvikt, som en förberedelse för bensonas behandling. </li><li> Behandla lunga med bensonas att ta bort resterna DNA: <ol><li> Värm bensonas buffert (se tabell av reagenser) till 37 ° C. </li><li> För varje lunga, fylla en 10 ml spruta med bensonas buffert bara och en 10 ml spruta med 90U/ml bensonas i buffert. </li><li> Stoppa perfusion av lungan. </li><li> Blås upp luftvägarna med bensonas buffert. </li><li> Låt lungan att tömma (för ~ 1 minut). Sedan blåsa lungan med bensonas lösningen. Under inflationen med bensonas buffert &amp; bensonas, försök att undvika att injicera all luft i lungorna. </li><li> Låt lungorna att sitta utan perfusion eller ventilation vid 37 ° C under 1 timme efter att blåsa med bensonas. </li></ol></li><li> Återuppta perfusion med PBS + 10% FBS, 10% penicillin / streptomycin som redan finns i bioreaktor, och fortsätter över natten. Följande dag, kan lungan antingen lagras vid 4 ° C (upp till 3 månader) eller iordningställda för cell sådd. </li><li> För att förbereda klätterställning för cellulära återinplantering, ersätter PBS / FBS / bensonas lösning med ~ 250 ml odlingsmedium. BEGJUTA i minst en timme innan cellerna införs ennd ersätta med färsk odlingsmedium direkt före sådd celler. </li></ol> 5. Recellularization Valet av cellen källa för orgel återsådd är kvar upp till de enskilda utredarna. Många cell källor kan användas, inklusive kommersiellt tillgängliga populationer nyligen isolerade neonatal eller foster pulmonell celler, embryonala stamceller eller kommersiellt tillgängliga källor cell. Särskilda isolering protokoll för dessa cellpopulationer kan hittas någon annanstans 4,5,6. Här ger vi instruktioner om hur man frö både endotel-och epitelceller populationer. Endothelial seedning: <ol><li> Bered en suspension av önskad endotelceller befolkningen, i lämpliga odlingsmedium. Filtrera cellsuspension genom ett 40um cell sil för att avlägsna celler klumpar. En typisk endothelial seeding i vårt laboratorium skulle utnyttja cirka 30 miljoner råtta lunga mikrovaskulära endotelceller i 60ml odlingsmedium. </li><li> Fördela cellsuspension i en liten behållare tillfälligt införlivats i perfusionen slinga av bioreaktor (Figur 2). Se till att slangen från denna reservoar och hela perfusionen slingan är fri från luftbubblor. </li><li> Ingjuta celler i lungartären på 3ml/min med rulle pump. </li><li> Efter cell infusion fortsätta perfusion med medelstora återcirkuleras från de största bioreaktor i önskad takt. </li><li> På daglig basis, se till att perfusionen slangen är fri från luftbubblor. </li><li> Medel bör ersättas med nya medel regelbundet, detta görs ofta var 3-4 dagar. </li></ol> Epitelial seedning: <ol><li> Bered en cellsuspension av önskad epitelceller befolkningen. I vårt laboratorium, består denna vanligtvis av cirka 5 till 10 nyfödda råttor pulmonell celler. Filtrera befolkningen genom 40um cell sil och suspendera i 15 ml odlingsmedium i en spruta. Fyll luftvägarna behållaren med 80 ml odlingsmedium. </li><li> Placera bioreaktor i ett 37 ° C vävnadsodling inkubator, och koppla sprutan pumpen för ventilation. Se till att alla ventilationen linjer är klara luft. <ol><li> Seed cellerna i lungorna genom att injicera 15 ml cellsuspension som en enda bolusinjektion i trakeal kanylen. </li><li> Omedelbart inleda en enda, långsam andning med sprutpump. Detta andetag administreras genom att dra tillbaka 60 ml luft från de största bioreaktor på 3ml/minute, vilket varar ungefär 20 minuter. Se till att luftfiltren om de viktigaste bioreaktor är täckta av omedelbart efter injektion cellsuspensionen och innan den långsamma andetag. </li></ol></li><li> Låt lungorna sitta statiskt för cirka 18hrs, och börjar sedan sakta vaskulär genomblödning (ca 0,5 ml / min). </li></ol> 6. Organ Kultur Även om detaljerna i perfusion och ventilation varierar beroende på experimentell design, är följande punkter noteras: <ol><li> Under endotel kultur, perfusion vanligen utförs vid 1-3 ml / min med hjälp av en rulle pump. Under epitelial kultur, ventilation vanligtvis ges på en kontinuerlig hastighet av 1 andetag per minut med en sprutpump. Återkallelse av 5-10ml luft från de största bioreaktor vanligen krävs för att verkställa lungventilation på en normal tidalvolym. På grund av behovet av att upprätthålla bioreaktor lufttät under ventilation, bör ventilationen pausas dagligen och luften i huvudsalen bör utbytas. All luft i systemet är rumsluften, vilket är cirka 21% syre i partialtryck. Det 5-10ml indragning av luft från bioreaktor (vilket framkallar en 5-10ml inspiration av vätska genom lungan) är baserad på storleken av lungan och hur många lober är under odlade (lober kan kopplas bort för analys, medan återstående loberna fortsätta i kultur). Den mängd luft tillbaka av sprutan pumpen valt att närma &quot;tidalvolymen&quot; av odlade lungan. </li><li> Medel bör bytas ungefär var 3-4 dagar under kultur. </li><li> Vid samtidig kultur av både epitel och endotel, experiment i vårt laboratorium vanligtvis först frö epitelet i 4-8 dagar, under vilken tid vävnadstekniska ventileras. Endotelet är då seedade via perfusionen, varefter vävnaden är både perfusion och ventilation. </li></ol> 7. Representativa resultat: Decellularization När protokollet görs korrekt bör den nyligen utvunna lungorna håller luft utan att läcka. Blåsa upp dem med luft medan nedsänkt i vätska kan kontrollera detta - det ska inte finnas några bubblor indikerar luftläckage. Den efterföljande decellularization bör ge ~ 500 ml decellularization vätskan att flöda genom lungorna under loppet av 2,5 - 3 timmar vid 37 ° C, och PBS i slutändan ska kunna flöda genom lungorna på cirka 10 ml / min (under ~ 15 mm Hg av hydrostatiskt tryck) i slutet av sköljningen. Efter behandling med 0,1% perättiksyra och bensonas kan lungorna lagras vid 4 ° C i upp till 3 månader, och fortfarande passar recellularization. Den slutliga decellularized extracellulärmatrix bör vara helt utan cellulära material, och behålla de grova, mikroskopiska och ultrastrukturella egenskaper infödda lunga. Otillräcklig decellularization eller sköljning kan resultera i kvarleva DNA &quot;fastnar&quot; till schavotten, som kan visualiseras med en vanlig hematoxylin och eosin bets (se figur 3 för jämförelse). Återplantering av acellulärt matris och kultur i lungvävnad Om celler nyligen isolerade från 7 dagar gamla nyfödda råttungar, som beskrivs i online komplettera medföljer arbete Petersen och kollegor 4, kan man förvänta sig en cell avkastning på 120-150 miljoner celler per kull på 10 valpar (drygt 10 miljoner celler per nyfödda barnet). Optimala förutsättningar för cell sådd och efterföljande kultur i lungan i bioreaktor bör ge väl fördelade celler i alla 5 lober i lungan, och bör ge täckning på cirka 70% av den extracellulära matrisen schavotten (Figur 3). De odlade celler befolkningen kommer att vara positivt för centrala luftvägarna cell markörer som pro-sekretoriska protein-C (SPC), Clara cell sekretoriska proteiner (CCSP) och aquaporin-5 (AQP), i den ordning relativa förekomst (Figur 4). <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Kanyler positioner och decellularization bioreaktor <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Bioreaktor används för sådd och kultur av tekniska lungvävnad <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Histologi av infödda, decellularized och nyinsatta lunga <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. Immunofluorescens färgning för centrala lung markörer

<ol>
	<li>American Lung Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lung Disease Data. , (2008).</li><li>Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+for+the+Long+Term+Culture+of+Lung+Tissue.">Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue.</a> Cell Transplant. , (2010).</li><li>Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+surface+tension+induced+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening.">Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).</li><li>Petersen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineerined+Lungs+for+in+Vivo+Implantation.">Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329, 538-5341 (2010).</li><li>Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat Med. 16, 927-9233 (2010).</li><li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation.">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).</li><li>Sugihara, H., Toda, S., Miyabara, S., Fujiuyama, C., Yonemitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+alveolus-like+structure+from+alveolar+type+II+epithelial+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture.">Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> Am J Pathol. 142, 783-7892 (1993).</li><li>Choe, M. M., Sporn, P. H., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+by+dynamic+strain+in+a+three-dimensional+tissue-engineered+human+airway+wall+model.">Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model.</a> American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).</li><li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-enginered+lung:+an+in+vivo+and+in+vitro+comparison+of+polyglycolic+acid+and+pluronic+F-127+hydrogel/somatic+lung+progenitor+cell+constructs+to+support+tissue+growth.">Tissue-enginered lung: an in vivo and in vitro comparison of polyglycolic acid and pluronic F-127 hydrogel/somatic lung progenitor cell constructs to support tissue growth.</a> Tissue Engineering. 12, 1213-1213 (2006).</li><li>Price, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Decellularized+Lung+Bioreactor+System+for+Bioengineering+the+Lung:+The+Matrix+Reloaded.">Development of a Decellularized Lung Bioreactor System for Bioengineering the Lung: The Matrix Reloaded.</a> Tissue Eng Part A. , (2010).</li><li>Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. 16, 814-820 (2010).</li><li>Shannon, J. M., Mason, R. J., Jennings, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+alveolar+type+II+epithelial+cells+in+vitro:+effects+of+cell+shape,+cell-matrix+interactions+and+cell-cell+interactions.">Functional differentiation of alveolar type II epithelial cells in vitro: effects of cell shape, cell-matrix interactions and cell-cell interactions.</a> Biochim. Biophys. Acta. 931, 143-156 (1987).</li><li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Acellular+Natural+Lung+Matrix+on+Murine+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation+and+Tissue+Formation.">Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation.</a> Tissue Eng Part A. , (2010).</li></ol>

LEN har lager i Humacyte, en regenerativ medicin företaget. Humacyte inte finansiera dessa studier, och påverkade inte utformning, tolkning, eller rapportering av någon av de experiment som beskrivs eller metoder. Författarna (LEN, THP, EAC) och Yale University har lämnat in en patentansökan gäller tissue engineering av lungorna.

Den mest kritiska aspekter av systemet som presenteras här omfattar underhåll av sterilitet, och noggrann övervakning av trycket som tillämpas på vaskulära sängen under hela processen med att utarbeta och sådd ställningen och odling den nyinsatta lungan. Sterilitet är bäst upprätthålls genom autoklavering allt material före användning, och genom att montera lungan i ett slutet system strax efter Explantation och undvika framtida brott mot denna barriär. Efter decellularized matrisen har sköljas och överföras till en steril bioreaktor för kultur bör silikon lock och andra sälar och anslutningar inte störas eller tas bort. För att hålla trycket i schack, är flödet drivs av gravitation att föredra när det är möjligt. När en pump krävs för recirkulation av vätska, med början efter sköljning med PBS och fortsätter under kultur, rekommenderar vi att direkt mäta trycket precis innan den vätska som går in i lungartären med en tryckgivare. Omfattningen av den tillämpade trycket bör inte överstiga 15 mm Hg. Recellularized lungorna kan odlas under olika tidsperioder, vanligen mellan 4 dagar och upp till 3 veckor. Vaskulär genomblödning är normalt ske vid 1-3 ml / min under endotelceller kultur, medan ventilation används vanligen med en hastighet av 1 andetag / min under epiteliala kultur. Under kombinerad kultur perioder är samtidig ventilation och perfusion lämpligt. Ventilationen kan utföras med antingen flytande medium eller luft. Under de senaste decennierna har flera grupper gjort ett viktigt arbete tissue engineering som visar möjligheterna att differentiera lung epitel in vitro och att replikera flera aspekter av lung microanatomy 7,8,9, 10. Men fram till nyligen, hade 4,5 ingen av dessa försök till ingenjör lungvävnad resulterade i en implanterbar organ som kunde upprätthålla separation mellan blodet och fack luftvägarna och som kunde delta i gasutbytet. Därför, trots de beskrivna metoderna är bara ett första steg mot det långsiktiga målet att skapa funktionella lungvävnad, är detta arbete ett uppmuntrande steg mot möjligheten att öka mängden lungvävnad tillgängliga för transplantation. Dessutom utvecklar detta arbete arbete som utförs av Ott et al. Och Uygun och kollegor 11,12, vilket visar effekten av en decellularized extracellulär matris som en klätterställning för komplexa tissue engineering tredimensionella strukturer och stödja tillväxt och överlevnad av olika typer av celler . Detta arbete är också betydande för dess bidrag till arsenalen av respiratoriska cell-och molekylärbiologer. Genom att erbjuda en unik tredimensionell miljö som också kan ge tillräckliga mekaniska stimuli, och som inte delar den åtföljande risk för snabb de-differentiering som man kan stöta på vid odling gnagare epitelet i laboratoriet med mer traditionella metoder 13, kunde forskarna använder vårt system för att få nya insikter i cell-cell och cell-matrix interaktioner som spelar en roll i cell differentiering och funktion. Denna kunskap kan vara särskilt stark om den används som hävstång för att styra ödet för olika populationer stamceller, som Cortiella grupp har visat i inledande studier 14.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (frivilligt) </th></tr><tr><td> Dödshjälp </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumnitroprussid </td><td> Fluka </td><td> 71.778 </td><td></td></tr><tr><td> Euthasol dödshjälp lösning </td><td> Virbac AH </td><td> 710.101 </td><td> 390 mg / ml pentobarbital natrium stamlösning skall spädas lämpligt för IP administration </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell Lösning </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> LÄDERBYXOR </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Amerikanska Bioanalytiska </td><td> AB01915 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Gibco </td><td> 14.190 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Bioreaktor Komponenter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 480 ml burk </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-3460560 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon propp, storlek 14 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.298-26 </td><td></td></tr><tr><td> Y-kopplingar </td><td> Cole Parmer </td><td> ED-30.614-08 </td><td> Används för arteriella och luftstrupen kanyler </td></tr><tr><td> Silikonslang </td><td> Masterflex </td><td> 96.420-14, 16 </td><td> L / S 14, 16 </td></tr><tr><td> Tryckgivare </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX-212 </td><td></td></tr><tr><td> Backventil </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-98.553-20 </td><td> Envägsventil </td></tr><tr><td> 4-vägs kranar </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 594WSC </td><td></td></tr><tr><td> Sprutfilter </td><td> Cole Parmer </td><td> 2915-08 </td><td> PTFE, 0.2μm </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell och sköljning apparati (tillägg till bioreaktor) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 och 1000 ml glasflaskor </td><td> Corning </td><td> 1395-500;-1L </td><td> Används för decell och sköljning av gravitationen </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Bensonas Behandling </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Amerikanska Bioanalytiska </td><td> AB14043 </td><td> 1M, pH 8,0 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> JT Baker </td><td> 2444-01 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> Bensonas nukleasfritt </td><td> Sigma </td><td> E1014 </td><td> Endonuclease vana vid från matrisen bort rest-DNA </td></tr></tbody></table>

procedure for lung engineering

Lungvävnad, bland annat lungcancer och kroniska lungsjukdomar såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom, sammantaget står för cirka 280.000 dödsfall årligen, kronisk obstruktiv lungsjukdom är idag den fjärde vanligaste dödsorsaken i USA 1. Bidragande till denna dödlighet är att lungorna i allmänhet inte reparera eller regenerera bortom den mikroskopiska, cellnivå. Därför är lungvävnad som är skadad av degeneration eller infektion, eller lungvävnad som opereras opererande inte är funktionellt ersättas in vivo. För att undersöka om lungvävnad kan genereras in vitro, behandlade vi lungorna från vuxna råttor genom ett förfarande som tar bort cellulära komponenter för att producera ett acellulärt lunga extracellulärmatrix schavotten. Denna byggnadsställning behåller den hierarkiska förgrenade strukturer luftvägar och kärl, liksom en stor del intakt basalmembran, som består av kollagen IV, laminin, och fibronektin. Ställningen är monterad i en bioreaktor avsedda att efterlikna kritiska aspekter av lung fysiologi, som t.ex. negativt tryck ventilation och pulserande vaskulär genomblödning. Genom odling av pulmonell epitel och vaskulära endotelet i bioreaktor-monterad byggnadsställning, kan vi generera lungvävnad som är fenotypiskt jämförbar med infödda lungvävnad och som kan delta i gasutbytet under korta tidsintervall (45 till 120 minuter). Resultaten är uppmuntrande, och föreslår att återplantering av lungan matrisen är en hållbar strategi för lung förnyelse. Denna möjlighet innebär en möjlighet att inte bara arbeta mot att öka utbudet av lungvävnad för transplantation, men också för att studera andningsorganen cell-och molekylärbiologi in vitro för längre tidsperioder och i en mer exakt mikromiljö än vad som tidigare varit möjligt.

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Lung Engineering at JoVE.com

Procedure for Lung Engineering

Vi har utvecklat en decellularized lunga extracellulär matrix och nya biomimetiska bioreaktor som kan användas för att generera funktionella lungvävnad. Genom att seeda cellerna i matrisen och odling i bioreaktor, skapar vi vävnad som demonstrerar effektivt gasutbyte när transplanterade in vivo för kortare perioder.

Förfarande för Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

Tillverkning av biologiskt härledda Injicerbara Material Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Elastomerisk PGS Byggnadsställningar i arteriellt Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Postproduktion Bearbetning av Electrospun Fibrer för Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kapillärkraften Litografi för Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingenjörs 3D Cellularized kollagengeler för kärlvävnad Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Syntes av keratin-baserad nanofiber för medicinsk teknik

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Framställning av termoresponsiv nanostrukturerade ytor för Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering av Intrinsic Vascularization i en<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering avdelningen

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Simuleras Bioprinting för Engineering vaskulariserad vävnad och Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Ett protokoll för Decellularizing mus Cochleae för innerörat Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...