עבודה זו נתמכה על ידי לענייני יוצאי צבא ו-NIH מענקים 5U01HL100398 ו 1R01HL104040.

1. עובריים (EB) היווצרות הגוף התחתון באמצעות 96 עגול גם צלחות microtiter <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים עובריים בעכבר בתא 10 ס&quot;מ צלחות תרבות עם המדיום הסלולרי ES העכבר בתוספת LIF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים ES מוכנים לשימוש (בדרך כלל בנקודת המפגש 50-70%), להסיר ולשטוף התקשורת ES תאים פעם עם PBS סטרילי 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2ml 0.05% טריפסין / EDTA על כל צלחת צלחות לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ~ 5 דקות, דובדבני טריפסין EDTA עם 3 מ&quot;ל התקשורת ES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים 50 מ&quot;ל צינורות בז ספין בסל&quot;ד 1000 למשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו resuspend תא גלולה עם כמות הרצויה של EB התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים תאים לדלל עד 5 x10 3 תאים / מ&quot;ל ב EB התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה רב להוסיף 100μl של EB התקשורת המכיל תאים לתוך הבאר כל אחד 96 - בסיבוב צלחות microtiter היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 96 - בסיבוב צלחות microtiter היטב באינקובטור. </li></ol> 2. זיהוי חלונות זמן קריטי של מסלול איתות מפתח (ות) עבור cardiogenesis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מאפננים של מסלולי איתות ספציפיים לשלוט ברכב לתוך הבאר כל אחד 96-היטב צלחות microtiter המכיל תאים ES בנקודות זמן שונות, כגון 0 היום, יום 1, יום 2, יום 3 יום 4, ועוד חצי בארות בכל 96 טוב, צלחת (48 בארות) משמשים עבור כל נקודת זמן ההתחלה של הטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את מאפננים ידי שינוי התקשורת EB עבור כל 48 בארות שונים בנקודות זמן לעצור. לדוגמה, כדי לקבל שני טיפולים ביום תאים ES החל מיום 0, לשטוף את מאפננים ביום 2. לטיפול יותר מ -48 שעות, שינוי התקשורת EB בתוספת מאפננים טריים כל יומיים עד לנקודות הזמן הרצוי לעצור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק התכווצות EB תחת מיקרוסקופ אחרי יום 7. ציון בארות עם קבלנות EBS כמו חיוביים כדי לקבל אחוזי להידבקות EBS עבור כל הקורסים זמן שונים לטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודות זמן קריטי עבור cardiogenesis ES הם מסגרות זמן שהכיל את האחוז הגבוה ביותר להידבקות EBS מטופלים על ידי מאפננים איתות בהשוואה לשלוט ברכב. </li></ol> 3. האימות של חלונות זמן של איתות עבור cardiogenesis ב EBS העשויים טיפות תלוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחות פטרי ידי הוספת עם 3-4 מ&quot;ל של PBS על מנת למנוע אידוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את שלבים 1.1 ~ 1.5 להכין תאים ES ב 4 תאים 2.5x10 / תא מ&quot;ל צפיפות סופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת לתוך תא חיידקי צלחת לצורך גישה קלה. בעזרת פיפטה רב, להוסיף 20 טיפות μl (המכיל כ - 500 תאים) על העפעפיים הפוכה. אין לאפשר את טיפות בודדות לגעת. בדרך כלל עפעף אחד יכול להתאים עד 80 טיפות. תהפכו את המכסה בחזרה על צלחת המכילה PBS. דגירה של 24 שעות או 48 שעות כדי לאפשר היווצרות EB באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את EB נוצר תלוי טיפות ממכסה כל אחד עם 3 מ&quot;ל של התקשורת EB ובריכת 2 מכסים של EBS כדי בצלחת פטרי חדש. הוסף מדיה EB על בהיקף כולל של 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת EBS ההשעיה על 0.2% מצופה ג&#39;לטין 6-גם צלחות ביום 4. באופן כללי 30 EBS מועברים גם כל אחד. הוסף מדיה EB כדי לקבל את הנפח הסופי 2 מ&quot;ל עבור כל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה איתות מאפננים את תקופת הזמן זיהו מ 96-היטב ניסויים צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב התכווצות EB תחת מיקרוסקופ אחרי יום 7 cardiogenesis עשוי להיות מאופיין יותר על ידי immunostaining, RT-PCR ועוד, במידת הצורך. </li></ol>

<ol>
	<li>Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+as+a+source+of+regenerative+cardiomyocytes.">Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes.</a> Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).</li><li>Foley, A. C., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+induction+by+Wnt+antagonists+depends+on+the+homeodomain+transcription+factor+Hex.">Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex.</a> Genes Dev. 19, 387-396 (2005).</li><li>Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stage-specific+biphasic+roles+of+Wnt/beta-catenin+signaling+in+cardiomyogenesis+and+hematopoiesis.">Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).</li><li>Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin,+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling,+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells.">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה ירידה תלוי כבר את השיטה המקובלת משמש ליצירת EB ו בידול חוץ גופית. עם זאת, מייגע גבולות הגמישות ניסיוני בשל חששות לוגיסטית. באותה מידה, תוצאות גם קשה יותר כדי לאמת את המיומנות של הנסיין הוא חיוני להיווצרות EB מניפולציה מוצלחת כמו טיפות תלוי. שיטה פשוטה יותר היא ליצור EBS בצלחת תחתית עגולה 96, וכן תהליך יחיד צעד. פורמט זה מאפשר בידול בתוך מבחנה להיות סטנדרטי יכול להכיל יותר תנאי הניסוי בשל הקלות של היווצרות EB ומניפולציה במורד הזרם (למשל בנוסף אפנן או הסרה). יתר על כן, 96-היטב את התבנית צלחת יכול להיות מותאם להיות כלי סינון יעיל בתאי גזע עובריים בעכבר.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר CGR8 תאים משמשים בעיקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני ES: התקשורת GMEM בתוספת 10% חום מומת FBS, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 0.05 mM 2-mercaptoethanol, ו 200 U / ml Murine LIF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני EB: הכן התקשורת IMDM עם 20% חום מומת FBS, 1.6 mM L-גלוטמין, 0.08 mM 2-mercaptoethanol ו 1X ממ ללא פתרון חומצת אמינו חיונית. </li></ul>

modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying  cardiogenic induction efficiency

דיפרנציאציה של בתאי גזע pluripotent נתונה לפיקוח הדוק על ידי ויסות של זמן ומרחב של מספר מסלולי איתות מפתח. אחד המכשולים כדי הבנה שלה כבר בשיטות מגוונות correlating שינויים של אירועים איתות מפתח יעילות בידול. אנו מתארים כאן את השימוש assay עובריים בעכבר (ES) בתאי גזע מבוסס לזהות חלונות זמן קריטי עבור Wnt / β-catenin והפעלה BMP אות במהלך אינדוקציה קרדיוגני. עד מניה קבלנות גופים עובריים (EBS) בתבנית צלחת 96-טוב, אנחנו יכולים במהירות לכמת יעילות קרדיוגני ולזהות חלונות זמן קריטי עבור Wnt / β-catenin והפעלה BMP אות במהלך זמן לאחר טיפולי אפנן ספציפיים. המנהל המתוארים כאן אינו מוגבל אינדוקציה לב לבד, יכול להיות מיושם כלפי המחקר של שושלות תאים רבים אחרים. בנוסף, פורמט 96-היטב יש פוטנציאל להיות מפותחים יותר כמו תפוקה גבוהה, assay אוטומטית כדי לאפשר בדיקה של השערות ניסיוניות מתוחכמות יותר.

Watch this Scientific Journal Video about Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency at JoVE.com

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

אנו מתארים את השימוש assay ES תא העכבר מבוסס לזהות חלונות זמן קריטי עבור Wnt / β-catenin והפעלה BMP אות במהלך אינדוקציה קרדיוגני. השיטה מספקת פלטפורמה סטנדרטית אשר מכמת אמין יעילות קרדיוגני, וזה החלים על המחקר של שושלות תאים אחרים.

השתנה עכבר תא גזע עובריים Assay מבוסס על כימות יעילות אינדוקציה קרדיוגני

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Interview: Bioreactors and Surfaced-Modified 3D-Scaffolds for Stem Cell Research

ראיון: bioreactors ועלו-Modified-3D פיגומים למחקר בתאי גזע

A Nature Editorial in 2003 asked the question  "Good-bye, flat biology?"  What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems,  ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

וידאו ביואינפורמטיקה ניתוח גדילה אנושי בתאי גזע עובריים קולוני

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Oct4GiP Assay כתב ללמוד גנים המווסתים גזע עובריים עכבר נייד תחזוקה עצמית והתחדשות

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...