Эта работа была поддержана по делам ветеранов и NIH гранты 5U01HL100398 и 1R01HL104040.

1. Эмбриональные орган (EB) образование использованием 96-круглым дном и микротитровальных пластин <ol><li> Расти ЭС клетках мыши в 10 см клеточных культур пластин с ЭСК мыши среде, дополненной LIF. </li><li> При ЭС клетки готовы к использованию (как правило, на 50-70% слияния), удалите ES СМИ и промыть клетки один раз с 5 мл стерильной PBS. </li><li> Добавить 2 мл 0,05% трипсин / ЭДТА на каждой пластине и инкубировать пластин при 37 ° С в течение 3 ~ 5 минут, Quench трипсина ЭДТА 3 мл СМИ ES. </li><li> Передача клетки 50мл сокола труб и спина при 1000 оборотов в минуту в течение 3 минут. </li><li> Удалить супернатант, и ресуспендируют осадок клеток с желаемым количеством EB СМИ. </li><li> Граф номер ячейки и разбавленных клетки до 5 × 10 3 клеток / мл в EB СМИ. </li><li> Используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 100 мкл EB средах, содержащих клеток в каждую лунку 96 - круглый луночных микротитровальных. </li><li> Место 96 - круглый луночных микротитровальных в инкубаторе. </li></ol> 2. Определение важнейших временные окна из ключевых сигнального пути (ы) для cardiogenesis <ol><li> Добавить модуляторы конкретных сигнальных путей и управления транспортным средством в каждую лунку 96-луночного микротитровальных чашек, содержащих стволовые клетки в различные моменты времени, например, день 0, день 1, день 2, день 3 и 4-й день и т.д. Половина скважин в каждом 96 -луночного планшета (48 скважин) используются для каждого момента времени начала лечения. </li><li> Промыть модуляторы, изменив EB СМИ за каждые 48 скважин на различных пунктов остановки времени. Например, чтобы получить два дня лечения ЭС клетки, начиная со дня 0, промыть модуляторы в день 2. Для какого-либо лечения более 48 часов, изменение EB среде с свежим модуляторы каждые два дня до желаемой точки остановить время. </li><li> Изучить EB сокращения под микроскопом после 7-й день. Оценка скважин с контрагентами ЭТ как позитивные, чтобы получить процент заражения ЭТ для каждого различные курсы время лечения. </li><li> Критических точек времени для cardiogenesis ES являются временными рамками, в которых содержались высокий процент заражения ЭТ лечиться сигнализации модуляторы по сравнению с управления транспортным средством. </li></ol> 3. Проверка временных окон сигнализации для cardiogenesis в ЭТ из висят капли <ol><li> Подготовка чашки Петри с добавлением 3-4 мл PBS, чтобы предотвратить испарение. </li><li> Выполните шаги 1,1 ~ 1,5 подготовить ЭС клеток в 2.5x10 4 клеток / мл конечного плотность клеток. </li><li> Вылейте смесь в ячейки бактериальных блюдо для быстрого доступа. Использование многоканальной пипетки внести 20 мкл капли (содержащий около 500 клеток) на перевернутую крышку. Не допускать отдельные капли на ощупь. Вообще одна крышка может поместиться до 80 капель. Переверните крышку над блюдом содержащие PBS. Инкубируйте в течение 24 часов или 48 часов, чтобы позволить Б. образования в инкубаторе. </li><li> Запивать EB формируется из висят капли из каждой крышке с 3 мл среды EB и бассейн 2 крышки ЭТ к новой чашки Петри. Добавить EB СМИ, чтобы общий объем 10 мл. </li><li> Передача ЭТ в виде суспензии на 0,2% желатин покрытием 6-луночных на 4 день. В целом 30 ЭТ передаются в каждую лунку. Добавить EB средств массовой информации, чтобы получить 2 мл конечного объема для каждой скважины. </li><li> Инкубируйте сигнализации модуляторы на период времени идентифицированы 96-луночного экспериментов пластины. </li><li> Соблюдайте EB сокращения под микроскопом за днем ​​7 и cardiogenesis может быть в дальнейшем характеризуется RT-PCR, иммунной и других, если это необходимо. </li></ol>

<ol>
	<li>Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+as+a+source+of+regenerative+cardiomyocytes.">Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes.</a> Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).</li><li>Foley, A. C., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+induction+by+Wnt+antagonists+depends+on+the+homeodomain+transcription+factor+Hex.">Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex.</a> Genes Dev. 19, 387-396 (2005).</li><li>Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stage-specific+biphasic+roles+of+Wnt/beta-catenin+signaling+in+cardiomyogenesis+and+hematopoiesis.">Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).</li><li>Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin,+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling,+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells.">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Висячей капли метод был обычный метод используется для EB формирования и дифференциации в пробирке. Однако, это трудоемкий и экспериментальные пределы гибкости из-за материально-технические проблемы. К тому же, результаты также более трудным для проверки, как мастерство экспериментатора имеет решающее значение для успешного формирования EB и манипуляции, как висят капли. Более простой способ заключается в форме ЭТ в круглым дном 96-луночный планшет в качестве одного этапа. Этот формат позволяет в пробирке дифференциации должны быть стандартизированы и могут вместить больше экспериментальных условиях из-за легкости формирования EB и вниз по течению манипуляции (например, добавление или удаление модулятор). Кроме того, 96-луночного формата пластины могут быть оптимизированы, чтобы быть эффективным инструментом скрининга в ЭС клетках мыши.

<ul><li> Мышь CGR8 клетки используются в основном. </li><li> ES среды: GMEM среде с 10% тепла инактивированной FBS, 2 мМ L-глутамина, 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола и 200 ед / мл мышиного LIF. </li><li> Е. Б. среды: Подготовка IMDM СМИ с 20% тепла инактивированной ФБС, 1,6 мМ L-глутамина, 0,08 мМ 2-меркаптоэтанол, и 1X MEM Номера для незаменимых аминокислот кислотный раствор. </li></ul>

modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying  cardiogenic induction efficiency

Дифференциация плюрипотентных стволовых клеток жестко контролируется временной и пространственной регуляции нескольких ключевых сигнальных путей. Одним из препятствий на пути ее понимание было различными способами при сопоставлении изменений ключевых сигнальных событий к дифференциации эффективности. Мы описываем здесь использовании мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) ячейке на основе анализа для выявления критических временные окна для Wnt / β-катенина и БМП сигнал активации в течение кардиогенного индукции. По забив для заключения контрактов эмбриональных органов (ЭТ) в 96-луночный планшет формата, мы можем быстро количественно кардиогенный эффективности и выявления важнейших временные окна для Wnt / β-катенина и БМП сигнал активации в течение времени следующие конкретные процедуры модулятора. Основные изложенных здесь не ограничивается сердечной индукции в одиночку, и может быть применен к изучению многих других клеточных поколений. Кроме того, 96-луночного формата имеет потенциал для дальнейшего развития, как высокая пропускная способность, автоматизированные анализа для обеспечения тестирования более сложных экспериментальных гипотез.

Watch this Scientific Journal Video about Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency at JoVE.com

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Мы описываем использование клетка мыши ES основан анализ, чтобы выявить критические временные окна для Wnt / β-катенина и БМП сигнал активации в течение кардиогенного индукции. Метод обеспечивает стандартизированную платформу, которая надежно количественно кардиогенный эффективности, и она применима к изучению других клеточных поколений.

Измененный мышиных эмбриональных стволовых клеток основанных Пробирной для Количественная Кардиогенный эффективность индукционной

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Вывод гемопоэтических стволовых клеток мышей эмбриональных стволовых клеток

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Вывод человеческих эмбриональных стволовых клеток на применение специфических иммунных сывороток в хирургии

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Interview: Bioreactors and Surfaced-Modified 3D-Scaffolds for Stem Cell Research

Интервью: Биореакторы и поверхностью из-Modified 3D-Строительные леса для исследования стволовых клеток

A Nature Editorial in 2003 asked the question  "Good-bye, flat biology?"  What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems,  ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Выделение и Вывод мышиных эмбриональных зародышевых клеток

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Видео биоинформатики Анализ человеческих эмбриональных роста клеток колонии стволовых

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в олигодендроцитов прекурсоров

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Эффективное Вывод прав Сердечная Прекурсоры и кардиомиоциты из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Эффективное Дифференциация эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов подходит для культивирования эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Oct4GiP Reporter Анализ по изучению генов, которые регулируют мышиных эмбриональных стволовых клеток обслуживания и Самообновление

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...