Detta arbete stöddes av Veterans Affairs och NIH bidrag 5U01HL100398 och 1R01HL104040.

1. Embryonala Body (EB) bildande med 96-rund botten och mikrotiterplattor <ol><li> Väx celler mus ES i kultur 10cm plattorna med musen ES-celler mediet kompletteras med LIF. </li><li> När ES-celler är klara för användning (i allmänhet med 50-70% sammanflödet), ta bort ES media och skölj celler gång med 5 ml sterilt PBS. </li><li> Tillsätt 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA till varje tallrik och tallrikar inkubera vid 37 ° C i 3 ~ 5 minuter, Släck trypsin EDTA med 3 ml ES medier. </li><li> Överför celler till 50ml falk rör och snurra vid 1000 rpm i 3 minuter. </li><li> Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten med önskad mängd EB medier. </li><li> Räkna mobilnummer och späd celler till 5 x10 3 celler / ml i EB medier. </li><li> Använd flerkanalspipett att lägga 100μl EB media som innehåller celler i varje brunn på 96 - runda och mikrotiterplattor. </li><li> Plats 96 - runda och mikrotiterplattor i en inkubator. </li></ol> 2. Identifiering av kritiska tidsfönster av de viktigaste signalväg (ar) för cardiogenesis <ol><li> Lägg modulatorer av specifika signalvägar och kontroll av fordon i varje brunn på 96-håls mikrotiterplattor med ES-celler vid olika tidpunkter som dag 0, dag 1, dag 2, dag 3 och dag 4, etc. Hälften av brunnar i varje 96 -brunnar (48 brunnar) används för varje start tidpunkt för behandling. </li><li> Tvätta ur modulatorer genom att ändra EB media för varje 48 brunnar vid olika stopptid poäng. Till exempel, att få två dagars behandling för ES-celler från dag 0, skölj modulatorer vid dag 2. För varje behandling längre än 48 timmar, ändra EB media kompletteras med färsk modulatorer varannan dag tills önskad poäng stopptid. </li><li> Undersök EB kontraktion under ett mikroskop efter dag 7. Betyg brunnarna med upphandlande EB som positiva för att få procent av upphandlande EB för varje olika kurser behandlingstid. </li><li> Den kritiska tidpunkter för ES cardiogenesis är de tidsramar som innehöll den högsta andelen av upphandlande EB behandlas genom att signalera modulatorer jämfört med fordonskontroll. </li></ol> 3. Kontroll av tidsfönster av signalering för cardiogenesis i EBS gjorda av hängande droppar <ol><li> Förbered petriskålar genom att tillsätta med 3-4 ml PBS för att förhindra avdunstning. </li><li> Följ steg 1,1 ~ 1,5 för att förbereda ES-celler vid 2.5x10 4 celler / ml sista celltäthet. </li><li> Häll cellen blandningen i bakterie-skål för enkel åtkomst. Använda flerkanalspipett, tillsätt 20 l droppar (som innehåller cirka 500 celler) på inverterad lock. Låt inte de enskilda droppar med beröring. Generellt ett lock rymmer upp till 80 droppar. Vänd locket tillbaka över skålen med PBS. Inkubera under 24 timmar eller 48 timmar för att EB bildas i en inkubator. </li><li> Tvätta EB bildas från hängande droppar från varje lock med 3 ml EB media och pool 2 lock av EBS till en ny petriskål. Lägg EB media till en total volym på 10 ml. </li><li> Överföring EB i suspension på 0,2% gelatin belagda 6-brunnars plattor på dag 4. I allmänhet 30 EB överförs till varje brunn. Lägg EB media för att få 2 ml slutliga volymen för varje brunn. </li><li> Inkubera signalering modulatorer vid den tidsperiod som identifierats från 96-brunnar experiment. </li><li> Observera EB kontraktion under mikroskop efter dag 7 och cardiogenesis kan dessutom karakteriseras genom RT-PCR, immunfärgning och andra, om det behövs. </li></ol>

<ol>
	<li>Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+as+a+source+of+regenerative+cardiomyocytes.">Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes.</a> Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).</li><li>Foley, A. C., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+induction+by+Wnt+antagonists+depends+on+the+homeodomain+transcription+factor+Hex.">Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex.</a> Genes Dev. 19, 387-396 (2005).</li><li>Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stage-specific+biphasic+roles+of+Wnt/beta-catenin+signaling+in+cardiomyogenesis+and+hematopoiesis.">Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).</li><li>Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin,+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling,+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells.">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).</li></ol>

Den droppe Metoden har den konventionella metod som används för EB bildning och in vitro-differentiering. Men det är mödosamt och begränsar experimentella flexibilitet på grund av logistiska problem. På samma sätt, resultaten är också svårare att validera som förmågan att försöksledaren är avgörande för framgångsrika EB bildning och manipulation som hängande droppar. En enklare metod är att bilda strandsandaler en rund botten 96-brunnar som ett enda steg. Detta format möjliggör in vitro differentiering vara standardiserade och kan rymma mer experimentella förhållanden på grund av den enkla EB bildning och nedströms manipulation (t.ex. modulator tillägg eller borttagande). Dessutom kan 96-brunnar format optimeras för att vara ett effektivt verktyg för screening i mus ES-celler.

<ul><li> Mus CGR8 celler används främst. </li><li> ES medium: GMEM media kompletteras med 10% värmeinaktiveras FBS, 2 mM L-glutamin, 0,05 mm 2-merkaptoetanol och 200 U / ml murina LIF. </li><li> EB medium: Förbered IMDM media med 20% värmeinaktiveras FBS, 1,6 mM L-glutamin, 0,08 mm 2-merkaptoetanol och 1X MEM icke-essentiell aminosyra-lösning. </li></ul>

modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying  cardiogenic induction efficiency

Differentiering av pluripotenta stamceller är hårt styrt av tid och rum reglering av flera viktiga signalvägar. Ett av hindren för dess förståelse har varit varierande metoder korrelera förändringar av viktiga signalsystem händelser till differentiering effektivitet. Vi beskriver här att använda en mus embryonala stamceller (ES) cell-baserad analys för att identifiera kritiska tidsfönster för Wnt / β-catenin och BMP signalen ljuder vid kardiogen induktion. Genom poängsättning för upphandlande embryonala organ (EBS) i en 96-brunnar format, kan vi kvantifiera snabbt kardiogen effektiviteten och identifiera avgörande tidsfönster för Wnt / β-catenin och BMP signalen ljuder under en tidsperiod efter specifika modulatorn behandlingar. De viktigaste beskrivs här är inte begränsad till hjärt induktion ensam, och kan användas mot studiet av många andra cell linjer. Dessutom har 96-bra format potential att vidareutvecklas som en hög genomströmning, automatiserad analys för att möjliggöra testning av mer sofistikerade experimentella hypoteser.

Watch this Scientific Journal Video about Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency at JoVE.com

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Vi beskriver användningen av en mus ES-cell-baserad analys för att identifiera kritiska tidsfönster för Wnt / β-catenin och BMP signalen ljuder vid kardiogen induktion. Metoden ger en standardiserad plattform som tillförlitligt kvantifierar kardiogen effektivitet, och det är som gäller för studiet av andra cell linjer.

Ändrad Mus embryonala stamceller baserad analys för att kvantifiera Kardiogen induktion Effektivitet

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivering av mänskliga embryonala stamceller genom Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Interview: Bioreactors and Surfaced-Modified 3D-Scaffolds for Stem Cell Research

Intervju: Bioreactors och ytbehandlade-Ändrad 3D-Ställningar för stamcellsforskning

A Nature Editorial in 2003 asked the question  "Good-bye, flat biology?"  What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems,  ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolering och Härledning av Mouse Embryonala Germinal celler

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatik Analys av mänskliga embryonala stamceller Colony Tillväxt

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiering av embryonala stamceller till Oligodendrocyte Prekursorer

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga Hjärtat prekursorer och Cardiomyocytes från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Effektiv Differentiering av embryonala stamceller från mus till Motorneuroner

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Beredning av mus Embryonala Fibroblastceller Lämplig för odling av humana embryonala och inducerade pluripotenta stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Oct4GiP Reporter analys för att studera gener som reglerar Mouse embryonala Underhåll Stem Cell och självförnyelse

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...