Name: lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction at JoVE.com

وأيد هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة وR01NS046835 R01AG034389 ، ومارس من منحة الدايمات 6FY08 - 322. شكر خاص مكرس لك السيدة اليانور براون (Miltenyi بيوتيك ، صحراء ، كاليفورنيا) الذي ساعد بشكل كبير على بصيرة لها في MACS التكنولوجيا. وقد قدمت بسخاء Miltenyi المواد المستخدمة للمظاهرة من التجارب في أي تكلفة. كما أنني ممتن للدكتور جوانجهو وانغ (كلية الطب في جورجيا / جامعة جورجيا العلوم الصحية ، أوغوستا ، GA) الذي ولدت PKCζ معربا عن خطوط الخلايا. ومن المسلم به أيضا دعم من قبل معهد الطب الجزيئي في كلية الطب في جورجيا / جامعة جورجيا للعلوم الصحية (في إطار الاتجاه من الدكتور لين مى).

1. مقدمة تم تطوير اللوني الدهون تقارب حويصلة بوساطة استخدام الفرز المغناطيسي تنشيط الخلية (LIMACS) تقنية في المختبر لدينا لعزل بروتين المجمعات سيراميد المرتبطة 1-3. في الأصل ، أدلى الحويصلات الدهني سيراميد وفسفاتيديل ، مما سمح لM...

<ol>
	<li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells.">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li><li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells.">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li><li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1.">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li><li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+C(16)-ceramide+between+phospholipid+vesicles.">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li><li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+(and+sociology)+of+ceramides.">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li><li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides.">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li></ol>

لاختبار مدى التفاعل بين محددة الدهون والبروتين ملزمة تعوقها تضمين الدهون في غشاء الخلية. غشاء الخلية يتكون من خليط من عدة الدهون والبروتينات ويتم تنظيمه في microdomains الدهون أو الطوافات. لذلك ، يمكن المشارك تنقية microdomains والبروتينات لا يميز بوضوح ما إذا كان بروتين يرتبط ...

وقدمت Annexin V - مترافق المغناطيسي والخرز الصغير وMACS minicolumns من قبل شركة Miltenyi ، بيوتيك (صحراء ، CA). كانت كل الدهون من أعلى نقاء والحصول عليها من الدهون أفانتي القطبية (المرمر ، AL).

lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction

تحليل التفاعل البروتين الدهني صعب جدا ، لأن جزءا لا يتجزأ من الدهون في أغشية الخلايا ، وبالتالي ، لا يمكن الوصول إليها إلى إجراءات أشد تنقية. كبديل ، يمكن أن تكون مغلفة الدهون على الأسطح المسطحة كما تستخدم لمأكل مثل الطحين والدهن ELISA الطيفي بالرنين. ومع ذلك ، والدهون طلاء السطح لا تشكل هياكل microdomain ، والتي قد تكون مهمة لخصائص الربط الدهون. مزيد من هذه الطرق لا تسمح لتنقية كميات أكبر من البروتينات ملزمة الدهون المستهدفة. للتغلب على هذه القيود المفروضة على اختبار البروتين الدهني التفاعل وتنقية البروتينات الشحمية ملزمة طورنا طريقة جديدة تسمى اللوني الدهون تقارب حويصلة بوساطة استخدام الفرز المغناطيسي تنشيط الخلية (LIMACS). في هذه الطريقة ، يتم إعداد حويصلات الدهن مع وجود الهدف والدهون مثل الدهون فسفاتيديل مرساة لMACS Annexin الخامس. فسفاتيديل هو غشاء الخلية التي تظهر في كل مكان فسفوليبيد تقارب عالية لبروتين خامسا Annexin باستخدام الخرز المغناطيسي مترافق إلى الخامس Annexin الحويصلات التي تحتوي على الدهون فسفاتيديل سوف ربط الخرز المغناطيسي. متى يتم تحضين الحويصلات الدهون مع خلية lysate أيضا البروتين الدهني ملزما للهدف أن تكون ملزمة للالخرز ويمكن أن يشترك في تنقية MACS به. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لمعرفة ما إذا البروتينات المؤتلف إعادة مجمع البروتين الدهني ملزما للهدف. وقد استخدمنا هذا الأسلوب لإظهار التفاعل بين PKC شاذة (aPKC) مع سيراميد الشحميات السفينغولية وشارك في تنقية استجابة الخلايا البروستاتا 4 (PAR - 4) ، وهو بروتين ملزمة لسيراميد المرتبطة aPKC. وقد استخدمنا هذا الأسلوب أيضا لإعادة هيكلة مجمع سيراميد المرتبطة من aPKC المؤتلف مع الخلية القطبية ذات الصلة والبروتينات Par6 Cdc42. حيث يمكن إعداد حويصلات الدهنية مع مجموعة متنوعة من الدهون الفوسفاتية أو sphingo ، LIMACS يقدم تنوعا لاختبار البروتين الدهني التفاعل في بيئة الدهون التي تمثل بشكل وثيق من أن غشاء الخلية. يمكن التعرف على البروتين الدهني إضافية المجمعات باستخدام تحليل البروتينات من البروتين الدهني الملزم الذي اشترك في المنقى مع حويصلات الدهنية.

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction at JoVE.com

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

لاختبار مدى تفاعل البروتين الدهني مع هدفها كنا MACS وAnnexin V - مترافق الخرز المغناطيسي وحويصلات الدهنية من الدهون المركبة المستهدفة وAnnexin فسفاتيديل V - ملزمة. هي بروتينات الدهنية منضم إلى الهدف المشترك تنقيتها وتحليلها بعد شطف من الخرز.

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Research

JoVE Journal

Biology

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

الطمع القائم على فحص التفاعل خارج الخلية (AVEXIS) للكشف قابلة منخفضة تقارب التفاعلات مستقبلات يجند خارج الخلية

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

تحليل خلية معينة من<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

الجمع بين الفرز المغناطيسي للخلايا الأم والاختبارات تذبذب لتحليل الجينوم عدم الاستقرار خلال الإنقسامية شيخوخة الخلايا في<em&gt; خميرة الخباز</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

تحديد MyoD Interactome عن طريق جنبا الى جنب الانجذاب تنقية جانب لقياس الطيف الكتلي

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

تنقية مجمعات الأصلية للدراسة الهيكلية باستخدام طريقة العلامة جنبا الى جنب الانجذاب

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

مغناطيسية تنشيط الخلية فرز الاستراتيجيات الرامية إلى عزل وتنقية الزليلي المستمدة من سائل الخلايا الجذعية الوسيطة من طراز الأرنب

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...