Name: lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de NIH beurzen R01NS046835 en R01AG034389, en de March of Dimes subsidie ​​6FY08-322. Een speciaal woord van dank is gewijd aan mevrouw Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), die enorm geholpen met haar inzicht in de MACS techniek. Miltenyi heeft royaal mits het materiaal wordt gebruikt voor de demonstratie van de experimenten zonder kosten. Ik ben ook dankbaar dat dr. Guanghu Wang (Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University, Augusta, GA) die de gegenereerde PKCζ uiten cellijnen. Ondersteuning door het Instituut voor Moleculaire Geneeskunde van het Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University (onder leiding van Dr Lin Mei) is ook erkend.

1. Introductie De lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van magnetische-geactiveerde cel sortering (LIMACS) techniek werd ontwikkeld in ons laboratorium te isoleren ceramide-geassocieerde eiwitcomplexen 1-3. Oorspronkelijk werden de lipide vesicles gemaakt van ceramide en fosfatidylserine, waardoor voor het MACS met behulp van magnetische deeltjes-geconjugeerd Annexine V (zeer affiene om fosfatidylserine) om de blaasjes en de bijbehorende eiwitten te isol...

<ol>
	<li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells.">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li><li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells.">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li><li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1.">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li><li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+C(16)-ceramide+between+phospholipid+vesicles.">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li><li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+(and+sociology)+of+ceramides.">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li><li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides.">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li></ol>

Voor het testen van de specifieke interactie tussen een lipide en zijn bindend eiwit wordt belemmerd door inbedding van lipiden in het celmembraan. De celmembraan bestaat uit een mengsel van verschillende vetten en eiwitten en het is georganiseerd in lipide microdomeinen of vlotten. Daarom kan de co-zuivering van microdomeinen en eiwitten niet duidelijk onderscheiden of een eiwit direct bindt aan een lipide of slechts verrijkt met een microdomain structuur. Andere methoden met behulp van bepaalde lipiden gecoate op oppe...

Annexine V-geconjugeerde magnetische kralen en MACS micro-en minicolumns werden verstrekt door Miltenyi Biotec, Inc (Auburn, CA). Alle lipiden waren van de hoogste zuiverheid en verkregen van Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).

lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction

De analyse van lipide-eiwit interacties is moeilijk omdat lipiden zijn ingebed in celmembranen en daarom ontoegankelijk voor de meeste zuivering procedures. Als alternatief kunnen lipiden worden gecoat op vlakke oppervlakken zoals gebruikt voor het lipide ELISA en Plasmon resonantie spectroscopie. Echter, coating lipiden vormen geen microdomain structuren, die belangrijk kan zijn voor de lipide bindende eigenschappen. Verder zijn deze methoden niet toe dat voor de zuivering van grotere hoeveelheden eiwitten te binden aan hun doel lipiden. Om deze beperkingen van het testen van lipide-eiwit interacties en het lipide-bindende eiwitten te zuiveren ontwikkelden we een nieuwe methode genoemd lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van magnetische-geactiveerde cel sortering (LIMACS). Bij deze methode zijn lipide blaasjes bereid met het doel lipiden en fosfatidylserine als anker voor de lipide Annexine V MACS. Fosfatidylserine is een alomtegenwoordige celmembraan fosfolipide dat een hoge affiniteit voor het eiwit annexine V. Met behulp van magnetische korrels geconjugeerd aan Annexine V de fosfatidylserine-bevattende lipide vesicles zal binden aan de magnetische korrels laat zien. Als de lipide vesicles worden geïncubeerd met een cellysaat het eiwit binding aan het doel lipide zal ook gebonden aan de kralen en kan mede worden gezuiverd met behulp van MACS. Deze methode kan ook gebruikt worden om te testen of recombinante eiwitten reconstrueren een eiwit complex binding aan het doel lipide. We hebben gebruik gemaakt van deze methode om de interactie van atypische PKC (aPKC) show met de sfingolipide ceramide en om samen te zuiveren prostaat apoptose respons 4 (PAR-4), een eiwit binding aan ceramide-geassocieerde aPKC. We hebben ook gebruik gemaakt van deze methode voor de reconstructie van een ceramide-geassocieerd complex van recombinant aPKC met de celpolariteit-gerelateerde eiwitten Par6 en Cdc42. Omdat lipide vesicles kunnen worden bereid met een verscheidenheid van sphingo-of fosfolipiden, LIMACS biedt een veelzijdige test voor lipide-eiwit interacties in een lipide omgeving die sterk lijkt op die van de celmembraan. Extra lipide-eiwit-complexen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van proteomics analyse van de lipiden bindend eiwit co-gezuiverd met het lipide blaasjes.

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction at JoVE.com

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Om de interactie van een proteïne test met haar doel lipide gebruikten we MACS en Annexine V-geconjugeerde magnetische kralen en lipide vesicles gesynthetiseerd uit het doel lipiden en Annexine V-bindend fosfatidylserine. Eiwitten gebonden aan de doelgroep lipide zijn co-gezuiverd en geanalyseerd na elutie van de kralen.

Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Research

JoVE Journal

Biology

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Aviditeit op basis van extracellulaire Interactie Screening (AVEXIS) voor de Scalable detectie van lage-affiniteit extracellulaire receptor-ligand interacties

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Een vloeibare fase Affiniteit Capture test met behulp van magnetische korrels aan eiwit-eiwit interactie te bestuderen: het poliovirus-Nanobody Voorbeeld

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Identificatie van MyoD Interactoomanalyse gebruik van Tandem Affinity Purification Gekoppeld aan massaspectrometrie

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...